人源性噬菌體抗體庫的構(gòu)建和CEA抗體的篩選及表達(dá).pdf

1、CEA是人們認(rèn)識最早的腫瘤相關(guān)抗原之一，它在胎兒的結(jié)腸表面表達(dá)量很高，而在成人CEA濃度很低。但成人患惡性腫瘤和某些炎性疾病時，CEA表達(dá)量會明顯升高。統(tǒng)計學(xué)資料表明大腸癌的CEA表達(dá)率為83.3％，肝癌為80％，肺癌為76.6％，乳腺癌為63.2％。CEA本質(zhì)是一類結(jié)構(gòu)復(fù)雜的糖蛋白，分子量180kDa。免疫熒光技術(shù)證明CEA存在于腫瘤細(xì)胞膜上，是細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)蛋白，且在細(xì)胞膜上的表達(dá)率有所不同。雜交瘤技術(shù)的建立使CEA單抗廣泛用于生物學(xué)

2、研究和醫(yī)學(xué)檢測與腫瘤治療，但其鼠源性引起的人抗鼠反應(yīng)(HAMA)以及完整單抗分子過大難以進入腫瘤組織內(nèi)限制了其發(fā)展。噬菌體展示技術(shù)的出現(xiàn)使得在細(xì)菌中克隆人的抗體基因、構(gòu)建抗體文庫、制備人源單克隆抗體成為現(xiàn)實，尤其通過該技術(shù)在體外模擬抗體生成過程，達(dá)到了不經(jīng)免疫制備抗體，展示了誘人的前景。 在構(gòu)建抗體庫時有諸多因素對庫的質(zhì)量有影響，最重要的是抗體基因的多樣性和成熟度，以及庫容量的大小。因此，我們在建庫時注意到(1)標(biāo)本取自腸系膜淋

3、巴結(jié)。淋巴結(jié)是哺乳類特有的，產(chǎn)生免疫應(yīng)答的重要器官。其淋巴小結(jié)內(nèi)95％的細(xì)胞為B細(xì)胞，且大多為轉(zhuǎn)化的大B細(xì)胞。這些B細(xì)胞受濾泡樹突細(xì)胞表面聚集的抗原的選擇作用，已經(jīng)過數(shù)次分裂和膜抗體結(jié)構(gòu)突變過程，只有其膜抗體與表面抗原有高度親和性的細(xì)胞才能保留繼續(xù)分裂和分化，其余的則均被淘汰，所以選擇淋巴結(jié)最終會獲得高親合力的抗體。(2)標(biāo)本來源于高表達(dá)CEA(＞10ng/ml)的結(jié)、直腸癌患者，以使得細(xì)胞中含高豐度的抗體mRNA。(3)提取總RNA時

4、，強調(diào)RNA的完整性，增加提取和純化RNA的步驟會減少RNA的多樣性，影響庫容，所以RNA的純度達(dá)到OD260/OD280的值在1.6以上即可。(4)先構(gòu)建輕鏈庫，后與克隆的重鏈基因相連，保證重鏈基因的多樣性。(5)制備高質(zhì)量的感受態(tài)細(xì)胞，嚴(yán)格電轉(zhuǎn)化操作，使空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化率達(dá)到109才能保證庫容達(dá)到107以上。從大腸癌患者的腸系膜淋巴結(jié)中一步法提取淋巴細(xì)胞總RNA約20μg，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，將十個患者的cDNA混合在一起，用PCR擴增κ

5、鏈和Fd段的基因(Fd段約700bp，κ鏈約640bp)。κ鏈基因經(jīng)純化、酶切、連接和電轉(zhuǎn)化，構(gòu)建κ鏈基因文庫，含2.5×107個轉(zhuǎn)化子，隨機挑取10個菌落行SacI+XbaI酶切檢測，重組率為70％。Fd段擴增產(chǎn)物克隆到κ鏈基因文庫質(zhì)粒中，計數(shù)集落測定庫容為5.2×106。XhoI+SpeI酶切檢測，F(xiàn)d段重組率為90％。用SacI+SpeI酶切檢測，F(xiàn)ab(約1400bp)重組率為30％。 在篩選抗體庫過程中，噬菌體種類、固

6、相介質(zhì)表面抗原密度或溶液中抗原濃度和清洗時間三個因素對篩選效率影響最大。噬菌體的影響隨利類不同，沒有一定規(guī)律，后兩個因素是指篩選的嚴(yán)密度。因本次構(gòu)建的抗體庫Fab重組率為30％，所以采用了五輪篩選，前兩輪采用中等的嚴(yán)密度，避免高親和力但低表達(dá)的噬菌體克隆丟失。后三輪嚴(yán)格篩選條件達(dá)到了篩選目的。第五輪Fab重組率達(dá)到100％，噬菌體滴度比第三輪增加了30倍。從第五輪篩選后得到的細(xì)菌菌落中挑取30個克隆制備單克隆噬菌體抗體，用ELISA測定

7、其抗原結(jié)合活性，其中有6個克隆呈陽性(以P/N＞4判定為陽性)，陽性率為20％。 挑選4株陽性噬菌體抗體感染大腸桿菌XL1-Blue，擴增后提取噬菌粒，構(gòu)建可溶性Fab表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1-blue，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后收集培養(yǎng)液上清及菌體裂解液上清。ELISA、Westernblot檢測均證實有3個克隆成功地表達(dá)了可溶性的Fab抗體蛋白，可溶性抗體與人CEA有特異結(jié)合活性。通過對克隆1的可變區(qū)進行序列測定分析與GenBan

8、k檢索，證實其與人免疫球蛋白IgG重鏈VH3堿基同源性為90％，氨基酸同源性為88.9％，差異主要集中在CDR2、CDR3區(qū)，輕鏈V區(qū)與人免疫球蛋白Vκ1堿基同源性為93％，氨基酸同源性為91％，CDRl、CDR2、CDR3區(qū)均存在氨基酸差異。根據(jù)同一家族中核苷酸序列同源性大于80％，說明所獲抗體基因重鏈屬于人抗體VH3家族，輕鏈屬于人抗體Vκ家族。 本研究以噬菌體展示技術(shù)得到了抗CEA的單克隆抗體并證實了該抗體的有效性，希望使