高脂誘導(dǎo)胰島素抵抗機(jī)理及花生四烯酸對(duì)胰島素抵抗預(yù)防作用研究.pdf

1、糖尿病分為1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus，T1DM)和2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)，其中2型糖尿病約占90[％]左右。目前認(rèn)為2型糖尿病的發(fā)病主要是在遺傳基礎(chǔ)上綜合多種環(huán)境因素的結(jié)果。其中高糖高脂飲食是一種重要的環(huán)境因素。胰島素抵抗(insulin resistance，IR)是2型糖尿病發(fā)病的重要基礎(chǔ)，貫穿于其發(fā)生﹑發(fā)展的整個(gè)過(guò)程。所謂胰島素抵抗是指一定量的胰島

2、素生物學(xué)反應(yīng)低于正常水平的一種狀態(tài)。如何預(yù)防2型糖尿病即胰島素抵抗的發(fā)生，已成為擺在人們面前的一個(gè)重要課題。
　　 無(wú)論是流行病學(xué)調(diào)查還是實(shí)驗(yàn)室研究表明，食物中不同類(lèi)型脂肪酸對(duì)胰島素抵抗發(fā)生產(chǎn)生不同影響，飽和脂肪酸過(guò)多可引發(fā)胰島素抵抗，而補(bǔ)充多不飽和脂肪酸可改善緩解胰島素抵抗?；ㄉ南┧?20：4，n-6)的化學(xué)結(jié)構(gòu)為5,8,11,14-二十碳四烯酸，是哺乳動(dòng)物體內(nèi)含量最多，分布最廣的一種高不飽和脂肪酸。
　　 在健康人

3、群中，肝臟、肌肉和脂肪組織擔(dān)任著維持血糖平衡的作用，而T2DM患者的這三種組織均存在胰島素抵抗。新近研究結(jié)果表明肝臟是胰島素作用的一個(gè)重要靶器官，肝臟中胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的缺陷，會(huì)直接關(guān)系到全身胰島素抵抗的發(fā)生和T2DM的發(fā)病。因此對(duì)肝臟胰島素抵抗發(fā)生機(jī)理和預(yù)防的研究尤為重要，有利于我們進(jìn)一步深入研究T2DM的發(fā)病機(jī)理，并探尋早期預(yù)防方法。
　　 本課題體內(nèi)外研究高脂誘導(dǎo)胰島素抵抗機(jī)理及花生四烯酸對(duì)胰島素抵抗的預(yù)防作用。HepG

4、2細(xì)胞源于人的肝胚胎瘤細(xì)胞，保留了肝細(xì)胞的許多生物學(xué)特性。體外研究以HepG2細(xì)胞為研究對(duì)象，將飽和脂肪酸軟脂酸(palmitate，PA)孵育HepG2細(xì)胞，誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞胰島素抵抗，加入PKC抑制劑，分析PKC在HepG2細(xì)胞形成胰島素抵抗過(guò)程中的作用；將軟脂酸和花生四烯酸共孵育HepG2細(xì)胞，分析花生四烯酸對(duì)HepG2細(xì)胞形成胰島素抵抗的預(yù)防作用。體內(nèi)研究以Wistar大鼠為研究對(duì)象，高脂飲食誘導(dǎo)形成大鼠胰島素抵抗模型，分析花

5、生四烯酸對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)大鼠全身胰島素抵抗的預(yù)防作用及對(duì)肝糖輸出和肝臟胰島素信號(hào)傳遞的影響。
　　 第一部分
　　 目的：從蛋白激酶C (PKC)信號(hào)通路角度，探討游離肪肪酸(FFA)引起肝臟胰島素抵抗的可能機(jī)制。
　　 方法：培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，同時(shí)設(shè)立對(duì)照組(control組)、軟脂酸組(PA組)、高胰島素組(HI組)。PA組、HI組分別用250mM軟脂酸(PA)、5×10-7 M胰島素處理24小時(shí)。然后con

6、trol組、PA組再根據(jù)胰島素刺激前加(+)與不加(-)PKC抑制劑CC (chelerythrine chloride)5mM預(yù)處理1小時(shí)，隨機(jī)分為兩亞組：control(-)、control(+)、PA(-)、PA(+)。葡萄糖氧化酶法測(cè)定胰島素刺激后12小時(shí)葡萄糖消耗量，蒽酮法測(cè)定胰島素刺激后3小時(shí)點(diǎn)細(xì)胞內(nèi)糖原含量，Western-blotting技術(shù)檢測(cè)15分鐘點(diǎn)胞內(nèi)P-Ser473 PKB、P-Ser21/9 GSK-3a/b

7、水平。
　　 結(jié)果：PA(-)組與HI組比較葡萄糖消耗量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。葡萄糖消耗量、細(xì)胞內(nèi)糖原含量、P-Ser473 PKB、P-Ser21 GSK-3a、P-Ser9 GSK-3b水平均顯示，PA(-)組與control(-)比較顯著降低(P<0.05)，control(+)與control(-)組比較略有升高但無(wú)顯著性差異；PA(+)與PA(-)組比較顯著升高(P<0.05)。
　　 結(jié)論：軟脂酸(2

8、50mM)體外成功誘導(dǎo)了HepG2細(xì)胞產(chǎn)生胰島素抵抗，PKC信號(hào)通路在FFA引起肝臟胰島素抵抗中起著重要的作用。
　　 第二部分
　　 目的：探討花生四烯酸(AA)對(duì)軟脂酸(PA)引起HepG2細(xì)胞胰島素抵抗的預(yù)防作用及其可能機(jī)制。
　　 方法：培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，設(shè)立對(duì)照組(control組)、軟脂酸組(PA組)、軟脂酸+花生四烯酸組(PA+AA組)、高胰島素組(HI組)。PA組、PA+AA組、HI組分別用25

9、0mM PA、250mM PA加20mM AA，5×10-7 M胰島素孵育24h。然后葡萄糖氧化酶法測(cè)定各組胰島素刺激后12h點(diǎn)葡萄糖消耗量，蒽酮法測(cè)定胰島素刺激后3h點(diǎn)細(xì)胞內(nèi)糖原含量，Western-blotting技術(shù)檢測(cè)15min點(diǎn)胞內(nèi)P-Ser473 PKB、P-Ser21/9 GSK-3a/b水平。
　　 結(jié)果：葡萄糖消耗量PA組與HI組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。葡萄糖消耗量、細(xì)胞內(nèi)糖原含量、P-Ser47

10、3 PKB、P-Ser21GSK-3a、P-Ser9 GSK-3b水平均顯示,PA組與control組比較顯著降低(P<0.05)，PA+AA組與PA組比較顯著升高(P<0.05)。
　　 結(jié)論：AA(20mM)能顯著預(yù)防PA(250mM)引起的HepG2細(xì)胞胰島素抵抗，能在PKB、GSK-3水平上顯著維持250mM軟脂酸孵育HepG2細(xì)胞的胰島素信號(hào)傳遞。
　　 第三部分
　　 目的：觀察花生四烯酸對(duì)大鼠全身胰

11、島素抵抗及肝糖輸出紊亂的預(yù)防作用。
　　 方法：將230～250g 24只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為3組：正常組(8例)，高脂組(8例)，高脂+花生四烯酸組即預(yù)防組(8例)，飼養(yǎng)12周。正常組：喂以基礎(chǔ)飼料；高脂組：喂以高脂飼料；預(yù)防組：喂以高脂飼料的同時(shí)，每天按3mg.kg-1.d-1劑量灌注花生四烯酸。飼養(yǎng)至第12周實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)，進(jìn)行口服葡萄糖耐受實(shí)驗(yàn)，基礎(chǔ)狀態(tài)下稱(chēng)量大鼠體重并處死，分離血清，測(cè)定血清中胰島素、血糖、甘油三酯

12、、膽固醇水平，取肝臟，測(cè)定肝糖原含量、磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶(PEPCK)酶活性及PEPCK、葡萄糖-6-磷酸酶(G-6-Pase)及糖原合酶(GS)mRNA水平，HE染色觀察各組大鼠肝細(xì)胞胞漿脂滴分布。
　　 結(jié)果：高脂組與正常對(duì)照組比較，基礎(chǔ)狀態(tài)下血清甘油三酯(P<0.05)、胰島素水平(P<0.05)、肝糖原含量(P<0.01)、葡萄糖-胰島素指數(shù)顯著升高(P<0.01)，但基礎(chǔ)狀態(tài)下體重?zé)o顯著性差異。預(yù)防組和高脂組比較，

13、肝糖原含量(P<0.05)、甘油三酯水平(P<0.05)、葡萄糖-胰島素指數(shù)(P<0.01)顯著降低，但與正常對(duì)照組比較，肝糖原含量(P<0.01)、葡萄糖-胰島素指數(shù)(P<0.01)顯著升高。高脂組與正常對(duì)照組比較，G-6-Pase mRNA水平顯著升高(P<0.01)，PEPCK酶活性及其mRNA水平略有升高，但無(wú)顯著性差異。預(yù)防組和高脂組比較，PEPCK酶活性及其mRNA水平(P<0.05)、G-6-Pase mRNA水平顯著降低

14、(P<0.01)，但3組大鼠GS mRNA沒(méi)有顯著性差異。HE染色觀察正常組肝細(xì)胞胞漿沒(méi)有脂滴，高脂組有大量大小不一的脂滴，預(yù)防組有少量大小不一的脂滴。
　　 結(jié)論：花生四烯酸能顯著預(yù)防高脂飲食誘導(dǎo)大鼠全身胰島素抵抗及肝糖輸出紊亂，但不徹底。
　　 第四部分
　　 目的：觀察花生四烯酸對(duì)高脂飲食大鼠肝臟胰島素信號(hào)傳遞影響的研究。
　　 方法：將230～250g 24只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為3組：正常

15、組(8例)，高脂組(8例)，高脂+花生四烯酸組即預(yù)防組(8例)，飼養(yǎng)12周。正常組：喂以基礎(chǔ)飼料；高脂組：喂以高脂飼料；預(yù)防組：喂以高脂飼料的同時(shí)，每天按3mg.kg-1.d-1劑量灌注花生四烯酸。飼養(yǎng)至第12周實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)，每組大鼠基礎(chǔ)狀態(tài)下腹腔注射胰島素(6U/kg)，15分鐘后取肝臟，Western blotting 技術(shù)分析P-Ser473 PKB、P-Ser21/9 GSK-3a/b水平。
　　 結(jié)果：高脂組與正常組比較

16、，P-Ser473 PKB及P-Ser21/9 GSK-3a/b水平顯著降低(P<0.01)，預(yù)防組與高脂組比較，P-Ser473 PKB(P<0.05)、P-Ser21 GSK-3a(P<0.01)及P-Ser/9 GSK-3b(P<0.05)水平顯著增加，但預(yù)防組與正常組比較，P-Ser473 PKB(P<0.05)及P-Ser21GSK-3a水平(P<0.01)顯著降低，P-Ser9 GSK-3b水平?jīng)]有顯著性差異。