反義PNA抑制端粒酶活性對肺癌A549細(xì)胞影響的研究.pdf

1、肺癌是惡性程度和發(fā)病率均較高的腫瘤之一，腫瘤的發(fā)生是一個多步驟的復(fù)雜過程，其發(fā)生發(fā)展與不同時期不同的原癌基因的激活和/或抑癌基因的失活有關(guān)，這些基因改變的結(jié)果最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞生長的無限制性。因此，針對某個癌基因、抑癌基因或某個細(xì)胞因子的基因治療，相對于腫瘤的整個過程來說就不可能取得滿意的結(jié)果。腫瘤治療的理想靶點是找到一個腫瘤細(xì)胞生長所必需的，而不存在于正常細(xì)胞的細(xì)胞成分。端粒酶是一些永生化細(xì)胞系和大多數(shù)腫瘤細(xì)胞中存在的具有特殊活性的酶類

2、，其參與了細(xì)胞的永生性轉(zhuǎn)化和腫瘤的形成。端粒酶在84-95％的人類惡性腫瘤細(xì)胞及永生化細(xì)胞中表達(dá)，而正常人體細(xì)胞，除生殖細(xì)胞及少數(shù)造血細(xì)胞低水平表達(dá)外，處于失活狀態(tài)。端粒酶在惡性腫瘤中的高表達(dá)，使其成為一個有潛力的腫瘤基因治療的理想靶點。 端粒是位于染色體末端具有特殊功能的DNA帽，由富含G的DNA重復(fù)序列TTAGGG和端粒結(jié)合蛋白所構(gòu)成的一種核蛋白復(fù)合體。它雖然不帶基因，但在保證染色體的完整性和穩(wěn)定性方面具有重要作用。隨著細(xì)胞

3、有絲分裂的進(jìn)行，端粒的長度逐漸縮短，當(dāng)端粒的長度縮短到一個臨界值后，染色體末端的穩(wěn)定機(jī)制被破壞，體細(xì)胞便會退出細(xì)胞周期而衰老死亡，亦即復(fù)制性衰老。 端粒酶是一種由RNA和蛋白質(zhì)構(gòu)成的具有逆轉(zhuǎn)錄酶功能核糖核蛋白酶，端粒酶激活，使端粒長度得以穩(wěn)定，細(xì)胞逃避死亡而獲得永生化，成為具有無限增殖能力的腫瘤細(xì)胞。端粒酶活性對于細(xì)胞的惡變和腫瘤細(xì)胞的形成具有極為重要的意義，如果能夠特異性地抑制腫瘤細(xì)胞的端粒酶活性，就可以阻斷腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期

4、，使其失去無限增殖能力，腫瘤停止生長，甚至自動消退而達(dá)到治療目的。端粒酶主要由三部分組成：端粒酶RNA組分、端粒酶相關(guān)蛋白及端粒酶催化亞基。端粒是以端粒酶的RNA為模板，通過端粒酶催化蛋白亞單位逆轉(zhuǎn)錄合成的，已有學(xué)者成功克隆了人端粒酶中的RNA成分，端粒酶中RNA序列中含有與端粒DNA序列互補(bǔ)的模板序列，那么抑制端粒酶活性的研究，就可以從端粒酶RNA組分、蛋白質(zhì)成分或者端粒酶催化亞單位等途徑來抑制端粒酶的活性：1.利用核苷類似物抑制端粒

5、酶活性；2.利用5反義技術(shù)抑制端粒酶活性；3.利用核酶技術(shù)抑制端粒酶活性；4.利用分化誘導(dǎo)劑抑制端粒酶活性；5.其他途徑。既往的研究主要針對端粒酶的RNA模板，利用反義核苷酸、硫代反義核苷酸等方法結(jié)合端粒酶模板，從而使端粒酶失去模板無法進(jìn)行端粒序列的擴(kuò)增。而端粒酶催化蛋白亞單位作為端粒酶活性的重要組成部分，其反義研究報道甚少。 肽核酸以化學(xué)性質(zhì)與核糖磷酸結(jié)構(gòu)完全不同的(2-氨基乙基)甘氨酸結(jié)構(gòu)單元作為骨架，堿基部分通過亞甲基羰基

6、連接于主骨架。在結(jié)構(gòu)上，肽核酸與核苷酸非常相似，但與核苷酸相比，有許多優(yōu)越之處。寡核苷酸中的磷酸二酯鍵極易被降解，且與DNA或RNA結(jié)合的敏感性不強(qiáng)，易受外部條件干擾，而肽核酸在體內(nèi)很穩(wěn)定，不被核酸酶和蛋白酶降解。由于肽核酸具有特異性和穩(wěn)定性高的優(yōu)勢，可以取代寡核苷酸作為反義藥物進(jìn)行端粒酶的研究。 本研究以hTERTmRNA模板區(qū)上游啟動子基因作為作用靶位，以人工合成并標(biāo)記熒光蛋白的反義肽核酸抑制此靶區(qū)，用脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染法將其轉(zhuǎn)染

7、肺腺癌A549細(xì)胞株，在倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染結(jié)果并進(jìn)行鑒定，觀察細(xì)胞生長情況，檢測不同時間和濃度下端粒酶活性值，用MTT法檢測細(xì)胞存活率，流式細(xì)胞分析術(shù)檢測各細(xì)胞周期的比例，在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采用RT-PCR、WesternBlot、免疫組化等方法探討反義PNA作用后肺癌細(xì)胞周期基因P14、P16的mRNA和蛋白的變化。 綜上所述，本研究得出以下結(jié)論： 1.癌組織中端粒酶活性高表達(dá)，相應(yīng)的癌旁組織低表達(dá)，肺良性病變組

8、織中不達(dá)；端粒酶活性的表達(dá)與肺癌的分期和轉(zhuǎn)移有關(guān)。端粒酶活性檢測可作為肺癌診斷和預(yù)后判斷的分子指標(biāo)。 2.反義PNA能成功轉(zhuǎn)染肺腺癌A549細(xì)胞，且在癌細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮抑制作用。 3.轉(zhuǎn)染反義PNA的A549細(xì)胞，其端粒酶活性隨著時間的延長和濃度的提高而降低，具有時間依賴性和濃度依賴性。 4.反義PNA能抑制肺癌細(xì)胞的生長，引起細(xì)胞發(fā)生凋亡。其抑制作用隨著時間的延長和濃度的提高而增強(qiáng)，亦具有時間依賴性和濃度依賴性。