幽門螺桿菌細(xì)胞毒素相關(guān)基因A蛋白（CagA）致病的分子機(jī)制研究.pdf

1、幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，H．pylori)是一種可長期定植于人類胃粘膜的革蘭氏陰性螺旋形微需氧菌，在全世界范圍內(nèi)感染率超過50％。H．pylori是引起慢性胃炎和胃十二指腸潰瘍的致病因子，流行病學(xué)和動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)H．pylori慢性感染是導(dǎo)致胃癌的重要危險(xiǎn)因素。H．pylori作為致病因子的特點(diǎn)雖已得到公認(rèn)，但有關(guān)其致病的分子機(jī)制及感染結(jié)局多樣性的本質(zhì)仍未闡明。細(xì)胞毒素相關(guān)基因A蛋白(Cytotoxin-ass

2、ociated gene A，CagA)是H．pylori重要的毒力因子之一，可經(jīng)cag致病島編碼的Ⅳ型分泌系統(tǒng)注入宿主細(xì)胞，通過依賴和或獨(dú)立于磷酸化的機(jī)制，與宿主細(xì)胞涉及調(diào)控細(xì)胞生長和運(yùn)動的多種蛋白相互作用，導(dǎo)致細(xì)胞功能異常。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，CagA陽性H．pylori菌株感染比CagA陰性菌株更易增加十二指腸潰瘍和胃癌等嚴(yán)重胃腸疾病發(fā)生的危險(xiǎn)性，提示CagA蛋白可能與H．pylori的致病作用有關(guān)。分析H．pylori感染引起極化

3、的單層上皮細(xì)胞基因水平的表達(dá)變化發(fā)現(xiàn)，超過90％的受影響基因依賴于cag致病島的作用，而在依賴于cag致病島的基因中有79％與CagA有關(guān)。因此，CagA可能是一種特殊的疾病相關(guān)蛋白，在H．pylori致病過程中發(fā)揮重要作用，進(jìn)一步研究CagA蛋白的生物學(xué)功能及其參與H．pylori致病的機(jī)制，對于揭示H．pylori復(fù)雜的致病效應(yīng)的本質(zhì)及闡明其致癌的分子機(jī)制具有重要意義。 本研究從不同側(cè)面就CagA的生物學(xué)功能及其致病的分子機(jī)

4、制進(jìn)行探討：首先，以臨床分離株MEL-Hp27為研究對象，克隆全長cagA基因，并對其進(jìn)行分子特征分析；然后，參考cagA基因全長序列，構(gòu)建cagA基因敲除突變株(Hp27/△cagA)，通過比較遺傳背景相同的野生株與突變株生物學(xué)特性差異及其對宿主細(xì)胞增殖和凋亡的影響，初步評價與cagA基因相關(guān)的生物學(xué)作用及其在細(xì)胞水平的毒性效應(yīng)；最后，利用蛋白質(zhì)組學(xué)方法比較野生株與突變株的菌體總蛋白表達(dá)譜差異，以及野生株與突變株攻擊胃粘膜上皮細(xì)胞Ge

5、s-1而引起的細(xì)胞總蛋白表達(dá)譜差異，篩選并鑒定與cagA基因有關(guān)的功能蛋白，為揭示CagA參與H．pylori致病過程的分子機(jī)制，探索其與胃癌的相關(guān)性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 實(shí)驗(yàn)方法： 1 H．Pylori的培養(yǎng)及基因組DNA的制備將H．Pylori國際參考株NCTC11637和本室臨床分離株MEL-Hp27(Hp27)分別接種于布氏平板上，37℃微需氧條件下培養(yǎng)。3天后收獲H．Pylori，抽提基因組DNA。 2 Hp

6、27 eagA基因克隆 2．1 引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增參考H．Pylori 26695基因組序列，分別針對cagA基因編碼區(qū)保守序列和位于cagA基因上、下游的結(jié)構(gòu)基因序列設(shè)計(jì)兩對PCR引物，交叉分段擴(kuò)增包括cagA基因編碼區(qū)、5′、3′非編碼區(qū)在內(nèi)的Hp27全長cagA基因序列。 2．2 cagA基因分子特征分析將測序獲得的cagA基因全長序列，登錄GenBank數(shù)據(jù)庫，對分離白不同地區(qū)的cagA基因編碼序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生

7、樹分析；并且比較cagA基因5′、3′非編碼區(qū)序列特征；在東亞地區(qū)分離株中選擇臨床背景清楚的菌株對其CagA分子氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生樹分析。 3 eagA基因打靶載體的構(gòu)建 3．1參考Hp27cagA基因測序結(jié)果，PCR擴(kuò)增cagA基因編碼區(qū)兩側(cè)翼序列，作為同源臂片段，并從pEGFP-N2質(zhì)粒上擴(kuò)增卡那霉素抗性基因完整編碼區(qū)(km<'R>)作為篩選標(biāo)記。 3．2將km<'R>連接于兩同源臂片段之間，共同插人到p

8、Bluescript SK Ⅱ(-)載體的多克隆位點(diǎn)中，構(gòu)建出帶卡那霉素抗性標(biāo)志的打靶載體pBSK-cagA-mutant。 4 cagA基因敲除突變株的構(gòu)建與鑒定 采用電穿孔法將打靶載體pBSK-eagA-mutant轉(zhuǎn)化入受體菌株Hp27中，在普通布氏平板上培養(yǎng)48h，而后轉(zhuǎn)涂于含卡那霉素(25μg/ml)的布氏平板上繼續(xù)培養(yǎng)3～6天，篩選出cagA基因敲除突變株(Hp27△cagA)，并經(jīng)PCR及測序驗(yàn)證。

9、 5 cagA基因敲除突變株Hp27△cagA的生物學(xué)特性分析 5．1應(yīng)用尿素酶試劑，檢測cagA基因敲除突變株Hp27△cagA與野生株Hp27的尿素酶活性差異，以國際參考株NCTC11637為陽性對照。 5．2采用0.3％半固體瓊脂穿刺法比較突變株與野生株的移行能力差別。 5．3以細(xì)胞與細(xì)菌粘附實(shí)驗(yàn)來評價突變株與野生株的粘附作用差異。 5．4突變株和野生株攻擊Hela細(xì)胞，國際參考株NCTC11637

10、為陽性對照，鏡下觀察細(xì)胞空泡樣變，并結(jié)合中性紅攝入法定量檢測各組空泡毒素活性。 6 cagA．基因敲除突變株Hp27△cagA在細(xì)胞水平的毒性效應(yīng) 6．1野生株、突變株分別與BGC823細(xì)胞共培養(yǎng)，在6h、12h、24h和48h觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。 6．2采用四唑藍(lán)(MTT)比色法檢測野生株與突變株對BGC823細(xì)胞增殖活性的影響。 6．3流式細(xì)胞儀檢測野生株、突變株與BGC823細(xì)胞共培養(yǎng)48h的細(xì)胞凋

11、亡情況。 7 蛋白質(zhì)組學(xué)方法 7．1樣品制備及濃度測定 收獲H．Pylori野生株與cagA基因敲除突變株，采用超聲兼Urea-CHAPS-DTT裂解法提取野生株與突變株菌體總蛋白備用；分別將含有野生株與突變株的細(xì)菌懸液加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，與胃粘膜上皮細(xì)胞Ges-1共培養(yǎng)，野生株組和突變株組細(xì)菌與細(xì)胞的比例均為100:1，10 h后收集Ges-1細(xì)胞，并采用超聲兼Urea-CHAPS-DTT裂解法提取細(xì)胞總蛋白備用

12、；Bradford法對細(xì)菌和細(xì)胞總蛋白進(jìn)行定量。 7．2雙向電泳、圖像分析、MALDI-TOF質(zhì)譜分析和蛋白質(zhì)鑒定應(yīng)用 等電聚焦(IEF)電泳和十二烷基磺酸鈉．聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)技術(shù)將野生株與突變株菌體總蛋白，及野生株與突變株分別攻擊的Ges-1細(xì)胞總蛋白分離，得到蛋白的雙向電泳圖譜；用GS-800圖像掃描儀獲得凝膠圖像，經(jīng)PDQuest軟件分析篩選差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)；從制備型凝膠上挖下蛋白質(zhì)點(diǎn)，膠內(nèi)

13、酶解后，經(jīng)基質(zhì)輔助電離解析飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)分析獲得蛋白質(zhì)點(diǎn)的肽質(zhì)量指紋圖譜(PMF)，搜尋蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫并聯(lián)合生物信息學(xué)，鑒定蛋白質(zhì)及分析其生物學(xué)功能。 7．3質(zhì)量控制差異 蛋白質(zhì)點(diǎn)的選擇與確定，是利用標(biāo)準(zhǔn)化后蛋白質(zhì)點(diǎn)的體積進(jìn)行比較分析，對具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的蛋白質(zhì)點(diǎn)才作為進(jìn)一步研究的對象。為保證雙向電泳的重復(fù)性，對每個樣品的蛋白質(zhì)電泳圖至少重復(fù)三次。 8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SPS

14、S11.0分析所有數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，兩組之間的比較采用t檢驗(yàn)，多組之間的比較根據(jù)資料特點(diǎn)相應(yīng)采用單因素方差分析或重復(fù)測量的方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)取a=0.05。 結(jié)論 1、克隆幽門螺桿菌MEL-Hp27全長cagA基因，發(fā)現(xiàn)除cagA基因編碼區(qū)序列外，cagA基因調(diào)控序列也存在東、西方地區(qū)性差異；系統(tǒng)發(fā)生樹分析發(fā)現(xiàn), 東亞分離菌株可以按CagA分子氨基酸序列特征分為包含胃癌分離株和不包含胃癌分離株的

15、兩個菌株群。 2、以源自中國的臨床分離株為基礎(chǔ)，構(gòu)建cagA基因敲除突變株，為研究幽門螺桿菌中國株cagA基因的功能奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 3、首次發(fā)現(xiàn)cagA基因敲除會抑制H.pylori的尿素酶活性，并會造成H.pylori的移行能力下降，該作用可能是cagA基因參與H.pylori致病過程的機(jī)制之一。 4、cagA基因可能是H.pylori抑制宿主細(xì)胞增值所必需的成分，該基因的敲除使H.pylori對細(xì)胞增值的抑制

16、作用消失。 5、首次發(fā)現(xiàn)cagA基因與H.pylori的抗氧化應(yīng)激蛋白(烷基過氧化氫物還原酶、超氧化物歧化酶和藥物活性調(diào)控因子)的表達(dá)有關(guān)，cagA基因可能直接或間接的影響H.pylori抗氧化應(yīng)激蛋白的表達(dá)，從而對于維持H.pylori正常的抗氧化應(yīng)激能力進(jìn)而確保其在宿主胃內(nèi)持續(xù)定植非常重要，這可能是CagA參與H.pylori致病的機(jī)制之一。 6、首次在H.pylori作用的胃粘膜上皮細(xì)胞總蛋白表達(dá)譜中，發(fā)現(xiàn)與cag