狼瘡性腎炎患者尿蛋白對人近端腎小管上皮細(xì)胞的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：提取并純化確診為LN患者的尿總蛋白；觀察LN患者尿蛋白對HK-2細(xì)胞發(fā)生表型改變的影響及對細(xì)胞外基質(zhì)合成的作用；觀察LN患者尿蛋白對HK-2細(xì)胞化學(xué)性趨化因子、促炎癥因子和生長因子表達(dá)的影響；探討LN患者尿蛋白刺激HK-2細(xì)胞化學(xué)性趨化因子、促炎癥因子和生長因子上調(diào)表達(dá)及表型改變的信號機(jī)制。 材料與方法：選擇6例初發(fā)LN患者，男1例，女5例，平均年齡27.4±2.3歲，均符合1982年美國風(fēng)濕病學(xué)會制定的SLE診斷標(biāo)準(zhǔn)。所

2、有患者的尿蛋白均大于1.0g/d，經(jīng)腎活檢證實(shí)有腎損害，且尚未開始腎上腺皮質(zhì)激素和(或)任何免疫抑制劑治療。收集患者24小時(shí)尿液，離心后將上清經(jīng)大容量不銹鋼濾器和0.45um濾膜過濾，再將濾液通過Labscale超濾器超濾，上述處理過的尿總蛋白予以0.22um低蛋白吸附的聚醚砜膜過濾除菌。凝膠沉淀法鱟試驗(yàn)確定不含內(nèi)毒素。冰凍干燥，保存于-20℃冰箱。 應(yīng)用免疫組織化學(xué)法鑒定傳代培養(yǎng)的HK-2細(xì)胞。以不同濃度(0、0.1、0.5、

3、1.0、2.5、5.0mg/ml)LN患者尿蛋白以及5.0mg/ml人血清白蛋白與HK-2細(xì)胞共同培養(yǎng)24小時(shí)，再用濃度為1mg/ml的LN患者尿蛋白分別與HK-2細(xì)胞共同培養(yǎng)0，1，3，6，12，24，48小時(shí)，觀察HK-2細(xì)胞受不同劑量、不同時(shí)間的LN患者尿蛋白刺激后，OPN/CD44、IL-1β和TNF-α、TGF-β1、α-SMA、CollagenⅠ的表達(dá)水平，用RT-PCR方法檢測其mRNA的表達(dá)水平，用Westernblot

4、和間接(或直接)免疫熒光方法檢測其蛋白水平的表達(dá)。用濃度為1mg/ml的LN患者尿蛋白和p38MAPK的特異性抑制劑SB203580一起與HK-2細(xì)胞共同培養(yǎng)0，1，3，6，12，24，48小時(shí)，觀察TGF-β1、α-SMA、CollagenⅠ、OPN/CD44、IL-1β和TNF-α的表達(dá)情況有何變化，用RT-PCR、Westernblot方法分別檢測其mRNA和蛋白的表達(dá)水平，并與未用p38MAPK的特異性抑制劑SB203580組進(jìn)

5、行比較。 所有計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，根據(jù)方差齊性檢驗(yàn)結(jié)果，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或SNK-q檢驗(yàn)。所有數(shù)據(jù)均用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，P＜0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果：①將6例患者24h尿液經(jīng)過除菌、除內(nèi)毒素處理后的尿蛋白樣品進(jìn)行凝膠沉淀法鱟試驗(yàn)，可發(fā)現(xiàn)與標(biāo)準(zhǔn)品對比，6份樣品均反應(yīng)陰性，證明不含內(nèi)毒素。冰凍干燥后，6例患者的尿蛋白總量達(dá)9.5克。②用LN患者尿蛋白以時(shí)間和濃度依賴的方式誘導(dǎo)H

6、K-2細(xì)胞上調(diào)表達(dá)TGF-β1，同時(shí)HK-2細(xì)胞合成細(xì)胞外基質(zhì)成份COLⅠ增多，α-SMA的表達(dá)也顯著上調(diào)。③用LN患者尿蛋白以時(shí)間和濃度依賴的方式刺激HK-2細(xì)胞，單核巨噬細(xì)胞趨化因子、OPN及其配體CD44mRNA和蛋白水平的上調(diào)表達(dá)；促炎癥因子IL-1β及TNF-αmRNA和蛋白水平的表達(dá)也顯著上調(diào)。④應(yīng)用p38MAPK的特異性抑制劑SB203580，能夠分別從mRNA及蛋白水平顯著抑制HK-2細(xì)胞在LN患者尿蛋白誘導(dǎo)下產(chǎn)生的OP

7、N、促炎癥因子IL-1β和TNF-α、致纖維化因子TGF-β1、以及α-SMA和COLⅠ的上調(diào)表達(dá)。 結(jié)論：①LN患者尿蛋白可刺激腎小管上皮細(xì)胞化學(xué)性趨化因子和粘附分子OPN及CD44、促炎癥因子IL-1β及TNF-α、轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β以及細(xì)胞外基質(zhì)成分COLⅠmRNA和蛋白水平的上調(diào)表達(dá)，同時(shí)刺激HK-2細(xì)胞發(fā)生表型改變，向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。②p38MAPK的特異性抑制劑SB203580可顯著下調(diào)上述因子的表達(dá)，提示p