人脂聯(lián)素基因的克隆、表達及其生物活性檢測.pdf

1、在過去的20多年，不論是發(fā)達國家還是發(fā)展中國家，超重和肥胖已成流行態(tài)勢，與之相關(guān)的2型糖尿病、心血管疾病和高血壓等疾病的發(fā)病率也不斷攀升。因此人們把目光轉(zhuǎn)向了在這些疾病中扮演著重要角色的脂肪組織，隨著大量脂肪細胞因子的發(fā)現(xiàn)，脂肪組織作為一種重要的內(nèi)分泌器官開始為人們所關(guān)注和重視。脂聯(lián)素是脂肪細胞分泌的蛋白，具有抗胰島素抵抗、抗糖尿病、抗動脈粥樣硬化的作用。 在對脂聯(lián)素近十年的研究中發(fā)現(xiàn)，低脂聯(lián)素水平不僅與胰島素抵抗以及2型糖尿病

2、相關(guān)，低脂聯(lián)素血癥還可出現(xiàn)在心血管疾病、高血壓、血脂異常等疾病中。血清脂聯(lián)素水平檢測可以做為胰島素抵抗和代謝綜合征的預(yù)測指標(biāo)；研究者認為，血中脂聯(lián)素水平檢測與糖化血紅蛋白檢測一樣具有相同的重要性。因此血漿脂聯(lián)素水平將是輔助診斷代謝性疾病以及評價某些抗糖尿病藥物療效的極佳的實驗室檢測指標(biāo)。 脂聯(lián)素是一種良好的胰島素增敏劑，其可直接作用于肝臟、骨骼肌，增強胰島素的敏感性。體外實驗研究還發(fā)現(xiàn)，脂聯(lián)素是G6Pase的抑制劑，重組的脂聯(lián)素

3、蛋白，可作用于體外培養(yǎng)的肝細胞，抑制糖異生，減少肝糖輸出。 研究目的：1.克隆和表達全長的脂聯(lián)素蛋白，以得到純化的重組蛋白和抗脂聯(lián)素的多克隆抗體。2.觀察重組脂聯(lián)素蛋白對大鼠原代肝細胞G6Pase轉(zhuǎn)錄水平的影響，檢測重組蛋白的生物活性。 實驗方法：1.從人的脂肪組織中提取總RNA,利用RT-PCR的方法得到人脂聯(lián)素基因全序列，構(gòu)建pMD18-T/adiponectin載體，經(jīng)PCR反應(yīng)使脂聯(lián)素DNA片段兩端加上attB位

4、點，將目的序列通過BP以及LR反應(yīng)克隆到表達載體pET-DEST42中，目的序列經(jīng)過測序鑒定；重組的陽性表達質(zhì)粒命名為pET-DEST42/adiponectin。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入DE3(BL21)感受態(tài)細胞中，IPTG誘導(dǎo)表達。超聲碎菌，處理包涵體，在變性條件下純化蛋白，蛋白利用NDSB201結(jié)合谷胱苷肽復(fù)性、透析除鹽并超濾濃縮。蛋白純度經(jīng)SDS-PAGE鑒定，Bradford法蛋白定量 2.重組蛋白通過背部皮內(nèi)多點注射的方法

5、，免疫兔子，每次蛋白量為100ug，8周后，頸靜脈取血，離心得到抗血清，用瓊脂雙擴散法測抗體滴度。3.大鼠原代肝細胞培養(yǎng)4小時后，在培養(yǎng)液中加入重組脂聯(lián)素，作用24小時，提取RNA，半定量RT-PCR的方法來測定重組蛋白對肝細胞G6Pase表達水平的影響。實驗結(jié)果：1.得到脂聯(lián)素表達載體pET-DEST42/adiponectin經(jīng)測序證實其插入的目的片段無誤。2.得到純化復(fù)性后的重組蛋白以及兔抗人脂聯(lián)素抗血清。3.體外實驗證實重組脂聯(lián)

6、素具備生物活性。重組脂聯(lián)素蛋白作用于大鼠原代肝細胞，濃度到達2000ng/ml即可抑制G6Pase的轉(zhuǎn)錄水平。 實驗結(jié)論：利用Gateway表達體系可以快速準(zhǔn)確地獲得重組表達載體，與傳統(tǒng)方法比較，這個表達體系效率較高，但不同的蛋白還是需要慎重選擇合適的融合標(biāo)簽和表達載體。 重組的全長脂聯(lián)素蛋白在2000-5000ng/ml濃度范圍內(nèi)都可使葡萄糖-6-磷酸酶轉(zhuǎn)錄水平下降，在5000ng/ml時，可使轉(zhuǎn)錄水平下降約40％。因