IKKα在胃癌中的表達及其對胃癌細胞增殖、轉(zhuǎn)移能力的影響.pdf

1、背景：
　　胃癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一,胃癌引起的死亡位居全球腫瘤相關(guān)性死亡的第二位。嚴重威脅了我國人民的健康并且影響了人民的生活質(zhì)量。胃癌的發(fā)生受多種因素影響,其具體詳細機制還有待闡明。傳統(tǒng)的細胞毒性的化學(xué)藥物對于轉(zhuǎn)移的胃癌的效力是有限的。目前許多涉及分子通路的研究都希望能以此作為胃癌治療的靶標(biāo)。在分子診斷方面的發(fā)展更加支持了新的分子靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)。NF-kB是重要的轉(zhuǎn)錄因子能調(diào)控許多生物學(xué)過程,包括炎癥、細胞存活或者死亡、細

2、胞周期。它的異常激活通常能夠?qū)е履[瘤的發(fā)生。IKKα是NF-kB通路必須的調(diào)控者,能夠通過改變核內(nèi)NF-kB調(diào)控基因啟動子區(qū)域繼而調(diào)控NF-kB下游基因的表達。研究證明IKKα能夠調(diào)控涉及細胞轉(zhuǎn)化、腫瘤發(fā)展、血管生成等相關(guān)靶基因的表達,因此它在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中有著極為重要的作用。近年來IKKα在前列腺癌、乳腺癌中的作用已有報道,但是關(guān)于其在胃癌中的表達情況和作用未見報道。
　　目的：
　　1.探索IKKα在胃癌組織及其相

3、應(yīng)癌旁組織,原發(fā)胃癌組織和相應(yīng)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織,高轉(zhuǎn)移潛能胃癌細胞MKN28-M和低轉(zhuǎn)移潛能胃癌細胞MKN28-NM中表達情況。
　　2.研究低表達IKKα對胃癌細胞體外遷移、侵襲及體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力的影響。
　　3.研究低表達IKKα對胃癌細胞增殖表型方面影響。
　　方法：
　　1.利用免疫組織化學(xué)的方法檢測IKKα在胃癌及癌旁,胃癌組織原發(fā)灶及其相應(yīng)轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織組織芯片中的表達情況,并分析其與臨床病理資料之間的相關(guān)

4、性。利用Western blot實驗方法及熒光定量PCR的方法在蛋白水平及 mRNA水平檢測高轉(zhuǎn)移潛能細胞 MKN28-M及低轉(zhuǎn)移潛能細胞MKN28-NM中IKKα的表達水平。
　　2.IKKα干擾慢病毒和對照慢病毒轉(zhuǎn)染MKN28-M胃癌細胞系,構(gòu)建穩(wěn)定低表達IKKα的MKN28-M細胞系,利用Western blot方法在蛋白水平驗證其干擾效率,同時運用熒光定量PCR實驗技術(shù)在mRNA水平上驗證IKKα干擾慢病毒的干擾效率。

5、r>　　3.利用體外劃痕實驗、Transwell遷移實驗、Transwell侵襲實驗觀察低表達IKKα后胃癌細胞體外遷移、侵襲能力的改變。
　　4.利用裸鼠尾靜脈注射的方法檢測低表達 IKKα后胃癌細胞在體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力的改變。
　　5.利用MTT實驗方法繪制低表達IKKα胃癌細胞的生長曲線,并利用平板克隆形成實驗來觀察胃癌細胞單個細胞的成瘤能力的改變。
　　結(jié)果：
　　1.免疫組化結(jié)果顯示:IKKα主要定位于細胞漿

6、,未見細胞核內(nèi)的染色。胃癌和癌旁組織芯片染色結(jié)果顯示,胃癌組織標(biāo)本陽性表達率為62％,癌旁組織標(biāo)本陽性表達率為24%。對胃癌組織原發(fā)灶及其相應(yīng)轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)復(fù)合芯片進行統(tǒng)計分析,結(jié)果顯示:胃癌組織原發(fā)灶陽性率為32%。胃癌相應(yīng)轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織陽性率為65%。將IKKα的表達水平與臨床患者病理學(xué)資料之間的相關(guān)性進行分析。統(tǒng)計結(jié)果顯示,IKKα的表達水平與患者性別、年齡無相關(guān)性,然而與腫瘤的侵潤深度(T,P<0.001)、淋巴結(jié)侵潤的數(shù)量(N,P

7、<0.001)、有無遠處轉(zhuǎn)移(M,P=0.001)密切相關(guān)。
　　2.Western blot及q RT-PCR結(jié)果顯示:IKKα在蛋白水平及mRNA水平上在高轉(zhuǎn)移潛能胃癌細胞系 MKN28-M中表達均高于低轉(zhuǎn)移潛能胃癌細胞系MKN28-NM。
　　3.Western blot及q RT-PCR結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染IKKα干擾慢病毒的MKN28-M細胞中 IKKα的表達無論是在蛋白水平還是在 mRNA水平均低于轉(zhuǎn)染對照慢病毒的MK

8、N28-M細胞。
　　4.劃痕實驗結(jié)果顯示:24小時進行觀察顯示MKN28-M-shcontrol細胞已經(jīng)向?qū)γ姘l(fā)生遷移,兩側(cè)細胞間的間隙已經(jīng)基本發(fā)生融合。MKN28-M-shIKKα細胞24小時和0小時相比較,兩側(cè)細胞間的距離變化不大。
　　5.Transwell實驗結(jié)果顯示:48小時 MKN28-M-shcontrol細胞移至 Transwell小室微孔膜下層的細胞數(shù)量明顯多于MKN28-M-shIKKα細胞。
　

9、　6.裸鼠尾靜脈注射實驗結(jié)果顯示:低表達IKKα的胃癌細胞產(chǎn)生肺臟轉(zhuǎn)移灶的數(shù)量明顯少于對照組,并且其形成的轉(zhuǎn)移灶結(jié)節(jié)大小亦小于對照組。
　　7.MTT生長曲線及平板克隆結(jié)果顯示:實驗組低表達 IKKα的胃癌細胞生長能力明顯低于對照組,平板克隆結(jié)果顯示對照組細胞克隆形成數(shù)量明顯高于實驗組低表達IKKα的胃癌細胞,對照組細胞克隆形成率為91.5%,實驗組細胞克隆形成率為58%,同時對照組細胞的克隆形成的集落也大于實驗組低表達IKKα的

10、胃癌細胞克隆形成的集落。
　　結(jié)論：
　　1.IKKα在胃癌中的表達水平顯著高于在癌旁組織中的表達,具有統(tǒng)計學(xué)意義(47/75 vs18/75),IKKα在胃癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織中的表達水平明顯高于胃癌組織原發(fā)灶(26/40 vs13/40),提示IKKα的表達水平與胃癌的轉(zhuǎn)移有著密切的關(guān)系。IKKα的表達與患者性別、年齡無相關(guān)性,然而與腫瘤的侵潤深度(T,P<0.001)、淋巴結(jié)侵潤的數(shù)量(N,P<0.001)、有無遠處轉(zhuǎn)移(