血清miRNA作為非小細(xì)胞肺癌診斷標(biāo)志物的研究.pdf

1、肺癌是發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，大部分的肺癌患者到了晚期才被發(fā)現(xiàn)。早期發(fā)現(xiàn)并加以干預(yù)可提高肺癌患者的生存時(shí)間，因而臨床亟需尋找一種具有較高敏感度和特異度的診斷方法。近年來(lái)有文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iRNA可以作為非小細(xì)胞肺癌的一個(gè)潛在的診斷標(biāo)志物，本研究旨在發(fā)現(xiàn)血清中異常表達(dá)的miRNA并能夠用以輔助診斷，另外，我們對(duì)其中一個(gè)miRNA，miR-660進(jìn)行了進(jìn)一步的功能研究。
　　我們選取了44例非小細(xì)胞肺癌患者和22例正常對(duì)照血清樣本用以

2、篩選非小細(xì)胞肺癌患者中異常表達(dá)的miRNA，另外我們選取了300例血清樣本，包括178例非小細(xì)胞肺癌患者和122例正常對(duì)照用來(lái)對(duì)發(fā)現(xiàn)的miRNA進(jìn)行驗(yàn)證。這300例樣本按照肺癌和正常對(duì)照分別隨機(jī)分為兩組，一組作為訓(xùn)練組用來(lái)建立miRNA的診斷模型，一組作為驗(yàn)證組用來(lái)驗(yàn)證診斷模型。在發(fā)現(xiàn)階段，我們選取了380個(gè)miRNA，通過(guò)TaqMan(@)miRNA ABC Purification試劑盒進(jìn)行了miRNA的提取，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR

3、的方法對(duì)miRNA的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-194、miR-652和miR-660在非小細(xì)胞肺癌患者血清中高表達(dá)，并且其中的一個(gè)miRNA，miR-660在20對(duì)非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)水平也高于相應(yīng)的癌旁組織，可以推測(cè)血清miR-660可能來(lái)源于肺癌組織。
　　在發(fā)現(xiàn)階段，3個(gè)miRNA(miR-194、miR-652和miR-660)被證實(shí)在非小細(xì)胞肺癌患者血清中高表達(dá)，之后通過(guò)大樣本的驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)miR-652和mi

4、R-660在肺腺癌和肺鱗癌中表達(dá)水平都有一定的提高(p＜0.01)。之后我們通過(guò)ROC曲線對(duì)miR-652和miR-660的診斷效率進(jìn)行了評(píng)價(jià)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-652在訓(xùn)練組和驗(yàn)證組的曲線下面積分別為0.819(95％CI:0.749-0.877)和0.819(95％ CI:0.747-0.877)，miR-660的曲線下面積為:訓(xùn)練組:0.735(95％CI:0.657-0.803);驗(yàn)證組:0.714(95％CI:0.634-0.7

5、85)。由于單個(gè)的miRNA的診斷效率還不是很高，我們將miR-652和miR-660通過(guò)二元logistic回歸方程進(jìn)行了組合，結(jié)果發(fā)現(xiàn)組合后的模型對(duì)非小細(xì)胞肺癌（肺腺癌和肺鱗癌）的診斷效率要優(yōu)于單獨(dú)的miR-660的診斷效率(p＜0.05)。在此基礎(chǔ)上，我們將該組合和臨床使用的腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-652和miR-660的組合在訓(xùn)練組和驗(yàn)證組中對(duì)非小細(xì)胞肺癌（肺腺癌和肺鱗癌）的診斷效率均要優(yōu)于CEA和CA125(p＜

6、0.05)。然而，Cyfra21-1對(duì)非小細(xì)胞肺癌（肺腺癌和肺鱗癌）的診斷效率與miR-652+miR-660的組合相差無(wú)幾。因此，我們將miR-652+miR-660與這三個(gè)腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行了隨機(jī)組合并計(jì)算了各個(gè)組合對(duì)非小細(xì)胞肺癌（肺腺癌和肺鱗癌）的診斷效率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-652+miR-660+Cyfra21-1為最優(yōu)組合，該組合能夠顯著提高肺腺癌的診斷效率，訓(xùn)練組的曲線下面積為0.941(95％ CI:0.881-0.977)，驗(yàn)

7、證組的曲線下面積為0.942(95％ CI:0.881-0.977)。但是對(duì)于肺鱗癌，miR-652+miR-660+Cyfra21-1組合的診斷效率依然和Cyfra21-1沒(méi)有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　由于miR-660在非小細(xì)胞肺癌中的功能研究甚少，我們選擇了miR-660進(jìn)行進(jìn)一步的功能學(xué)研究，通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-660的抑制劑，發(fā)現(xiàn)miR-660表達(dá)水平的降低能夠抑制肺癌細(xì)胞系A(chǔ)nip973的侵襲、遷移和增殖能力。抑制miR

8、-660的表達(dá)水平能夠誘導(dǎo)細(xì)胞周期G2/M的阻滯進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖。之后我們使用生物信息學(xué)方法對(duì)miR-660的下游靶基因進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)PCDH9的3'UTR可以和miR-660的種子序列互補(bǔ)結(jié)合。PCDH9是原鈣粘蛋白超家族的一個(gè)成員，其在不同的腫瘤組織中的表達(dá)水平均低于癌旁組織。我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌組織中miR-660水平的降低會(huì)導(dǎo)致PCDH9的表達(dá)水平的升高，即miR-660和PCDH9的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。以上結(jié)果說(shuō)明