耐鹽微生物的分離及兩株耐鹽真菌次級代謝產(chǎn)物的研究.pdf

1、耐鹽微生物生存和培養(yǎng)于極端環(huán)境中，這種特殊的環(huán)境可能激活了該類微生物的某些沉默基因，從而產(chǎn)生結(jié)構(gòu)特殊的蛋白，進(jìn)而誘導(dǎo)出獨(dú)特的生物代謝途徑，使得其次級代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)新穎、種類繁多。因此，耐鹽微生物是新結(jié)構(gòu)活性化合物的重要來源。為了尋找耐鹽微生物中的天才菌株(Talented strain)和結(jié)構(gòu)新穎的活性化合物，本論文采用了化學(xué)與生物活性相結(jié)合的集成篩選方法，開展了生產(chǎn)抗腫瘤活性代謝產(chǎn)物的耐鹽微生物的研究工作。內(nèi)容包括：耐鹽微生物的分離與抗

2、腫瘤活性篩選；活性菌株的初步評價(jià)、天才菌株的獲得及抗腫瘤活性成分的追蹤分離；單體化合物的結(jié)構(gòu)解析；單體化合物抗腫瘤活性的初步評價(jià)。 采用海蝦生物致死法、K562細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)篩選模型、抗氧化及抑菌試驗(yàn)篩選模型，以細(xì)胞周期抑制、細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)，結(jié)合化學(xué)篩選，從19個(gè)分別采自內(nèi)蒙古吉蘭泰鹽場和青海湖高鹽環(huán)境的樣品(其中13個(gè)泥樣品，6個(gè)水樣)中分離得到了174株耐鹽微生物，從中篩選出3株活性菌，其中1株為天才菌株。 采用薄層

3、色譜，硅膠柱色譜，Sephadex LH-20柱色譜，反相高效液相色譜等分離手段，通過解析波譜數(shù)據(jù)并結(jié)合理化常數(shù)闡明了從耐鹽變色曲霉Aspergillus variecolor B-17中分得的49個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)：variecolortide A-C(1-3)，variecolorins A-N(4-17)，neoechinulin A(18)，preechinulin (19)，neoechinulin B(20)，(21)，dihy

4、droxyisoechinulin(22)，isoechinulin A(23)，tardioxopiperazine A(24)，tardioxopiperazine B(25)，isoechinulin B(26)，echinulin(27)，Alkaloid E-7(28)，cryptoechinuline G(29)，variecolorquinones B (30)，variecolorquinones A(31)，(2S)-

5、2,3-dihydroxypropyl-1，6，8-trihydroxy-3-methy1-9，10-dioxoanthracene-2-carboxy late(32)，emodin(33)，physcion(34)，questin(35)，questinol (36)，eatenarin(38)，erythroglaucin(39)，rubrocristin(40)，eurotinone(41)，2-methyleurotinone

6、(42)，flavoglaucin(43)，aspergin(44)，dihydroauroglaucin(45)， 2-(1，1-dimethyl-2-propen-1-y1)-1H-Indole-3-carboxaldehyde (46)，diisobutyl phthalate (47)，butyrolactone I(48)，halobutyrolactone A(49)；從另一株耐鹽微生物THW-18中分得的27個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)

7、：halotolerantcerebroside A-C(50-52)，cerebroside C(53)，cerebroside D(54)，(22E,24R)-3β，5α-Dihydroxy-23-methylergosta-7，22-dien-6-one(55)，(22E,24R)-3β，5α-Dihydroxy-ergosta-7，22-dien-6-one(56)，(22E，24R)-3β，5a，9α-trihydroxyer

8、gosta-7，22-diene-6-one(57)，(22E，24R)-23-Methylergosta-7，22-diene-3β，5α，9α-triol(58)，cerevisterol(59)，3β，5a-dihydroxy-6β-methnoxyergosta-7，22-diene(60)，ergosterol peroxide(61),ergosterol(62)，demethylineisterol A3(63)，halo

9、acetylaranotin A(64)，bisdethiodi(methylthio)acetylaranotin(65)，acetylaranotin(66)，alterperylenol(67)，dihydro-alterperylenol(68)，altertoxin I(69)，bis(2-ethylhexyl) phthalate (70)，N-acetyltyramine(71)，cyclo-(Tyr-Pro)(72)，(

10、15Z)-octadecenoic acid(73)，(13Z)-hexadecenoic acid(74)，benzoic acid(75)，guanosine(76)。其中，生物堿類化合物1-17、醌類化合物30-3l、丁內(nèi)酯類化合物49、腦苷脂化合物50-52、甾醇類化合物56和含硫的環(huán)二肽類化合物64均為新化合物。 利用流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合形態(tài)學(xué)檢測、MTT和SRB法，對所分得的新結(jié)構(gòu)單體化合物的體外抗腫瘤活性進(jìn)行了初步評價(jià)。

11、結(jié)果表明，新化合物1-3對K562細(xì)胞有弱的增殖抑制活性；新化合物4-17對P388、A-549、HL-60和BEL-7402細(xì)胞都具有較弱的細(xì)胞毒活性；新化合物30對多種人癌細(xì)胞及哺乳動(dòng)物癌細(xì)胞有較強(qiáng)的細(xì)胞增殖抑制活性；新化合物31對人肺癌A-549細(xì)胞具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒活性；新甾醇類化合物56對HL-60有一定細(xì)胞增殖抑制活性。在自由基清除試驗(yàn)中，新化合物17顯示較強(qiáng)的自由基清除活性；新化合物1-14和31顯示中等強(qiáng)度的自由基清除活性

12、；新化合物64顯示弱的自由基清除活性；已知化合物41-45顯示較強(qiáng)的自由基清除活性；化合物18、20、22、23、26、28、29、32-40顯示中等強(qiáng)度的自由基清除活性；67-69顯示弱的自由基清除活性。 綜上，本文經(jīng)活性篩選從174株耐鹽微生物中獲得3株活性菌，其中1株為“Talented strain”；通過對2株“Talented strain”中次級代謝產(chǎn)物的系統(tǒng)研究，共分離鑒定了76個(gè)化合物，其中新化合物25個(gè)。首次