ADSCs在體內(nèi)-外環(huán)境下的生物學(xué)效應(yīng)研究.pdf

1、2001年Zuk等人首次從人體內(nèi)的脂肪組織中分離得到了脂肪來(lái)源的成體干細(xì)胞(adipose-derivedstemcells,ADSCs),并進(jìn)行了體外分離、培養(yǎng)和傳代。目前,已證實(shí)ADSCs是一類具有多向分化潛能中胚層來(lái)源的干細(xì)胞,可誘導(dǎo)分化為骨、軟骨、脂肪、骨骼肌和神經(jīng)等細(xì)胞,已成為近年來(lái)再生醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。ADSCs具有組織相容性好、低免疫原性、多向分化潛能強(qiáng)、含量豐富、取材容易,給患者帶來(lái)的痛苦小,研究和應(yīng)用時(shí)不涉及倫理等優(yōu)

2、勢(shì),已作為優(yōu)良的種子細(xì)胞,應(yīng)用于組織損傷修復(fù)、免疫細(xì)胞治療和抗腫瘤基因治療等領(lǐng)域,在臨床治療中有廣泛的應(yīng)用前景。
　　然而,同其他成體干細(xì)胞一樣,ADSCs的培養(yǎng)也不可避免的遇到一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題,即體外培養(yǎng)過(guò)程中ADSCs逐漸老化甚至腫瘤化。主要表現(xiàn)在ADSCs傳代過(guò)程中其增殖能力逐漸減弱,并可能喪失其多向分化潛能,一般認(rèn)為體外培養(yǎng)60代以上可能會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)槟[瘤細(xì)胞。ADSCs在體外大量擴(kuò)增導(dǎo)致其增殖分化能力降低,從而限制了其臨床應(yīng)用且具

3、有難以預(yù)料的生物安全性風(fēng)險(xiǎn)。令人感興趣的是:體內(nèi)存活的ADSCs以及其他成體干細(xì)胞可以長(zhǎng)時(shí)間保持干細(xì)胞特性,而體外培養(yǎng)環(huán)境下的成體干細(xì)胞卻出現(xiàn)上述結(jié)果,什么因素觸發(fā)了體外培養(yǎng)干細(xì)胞的轉(zhuǎn)變?而又是什么因素維持著體內(nèi)生存的細(xì)胞干性呢?
　　關(guān)于體內(nèi)外微環(huán)境方面,近年來(lái)國(guó)內(nèi)外的研究主要集中在:改良生長(zhǎng)添加劑,包括將胎牛血清(fetalbovineserum,FBS)替換成人AB異種血清和凝血酶活化的富含血小板的血清,能夠增強(qiáng)間充質(zhì)干細(xì)胞

4、的成骨、成軟骨和成脂分化能力,同時(shí)又有促進(jìn)其增殖作用;添加生長(zhǎng)因子,即在無(wú)血清的培養(yǎng)基中添加各種生長(zhǎng)因子來(lái)提高ADSCs的分化潛能;細(xì)胞外基質(zhì)培養(yǎng)基,有學(xué)者認(rèn)為在體外培養(yǎng)時(shí)容易喪失干細(xì)胞特性,緣于離開了其生長(zhǎng)的特定微環(huán)境,因此將干細(xì)胞培養(yǎng)在其來(lái)源的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix,ECM)中發(fā)現(xiàn),這種ECM有利于干細(xì)胞的增殖,并能抑制其自發(fā)性分化;生物反應(yīng)器,即模擬體內(nèi)的生長(zhǎng)條件,選擇適合哺乳類動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)的因素培養(yǎng)細(xì)

5、胞,觀察其增殖和分化能力;還有學(xué)者采用中藥成分進(jìn)行研究。
　　微環(huán)境誘導(dǎo)分化學(xué)說(shuō)指出,在干細(xì)胞生存的微環(huán)境中可能存在影響分化潛能的某種因子,即在特定的體內(nèi)微環(huán)境中,干細(xì)胞通過(guò)與各種細(xì)胞因子、激素、細(xì)胞基質(zhì)及其他細(xì)胞的相互作用,導(dǎo)致調(diào)控干細(xì)胞分化的關(guān)鍵基因表達(dá),以決定分化潛能。
　　由于體內(nèi)的微環(huán)境在體外條件下極難完全模擬,根據(jù)以上理論,我們通過(guò)“體內(nèi)生物反應(yīng)器”將ADSCs植入其來(lái)源的動(dòng)物大網(wǎng)膜微環(huán)境中,對(duì)比觀察體內(nèi)體外培養(yǎng)

6、的干細(xì)胞生物學(xué)特性和干性基因的改變,并采用質(zhì)譜分析的方法對(duì)體內(nèi)相關(guān)生長(zhǎng)因子進(jìn)行了初步分析,以期探索體內(nèi)環(huán)境中對(duì)其干性影響的因素,為改良培養(yǎng)基奠定基礎(chǔ)。
　　主要工作和結(jié)果:
　　1.實(shí)驗(yàn)中采用了“改良Ⅰ型膠原酶法”分離和純化SD大鼠ADSCs,經(jīng)過(guò)體外培養(yǎng),傳代擴(kuò)增,建立了體外分離、培養(yǎng)和擴(kuò)增ADSCs的高效、穩(wěn)定、簡(jiǎn)單的方法;經(jīng)成骨、成脂誘導(dǎo)培養(yǎng),并通過(guò)油紅O染色和茜素紅染色鑒定證實(shí),體外培養(yǎng)的ADSCs具有成骨、成脂肪分

7、化的潛能,采用流式細(xì)胞儀測(cè)定ADSCs表面標(biāo)志物,符合ADSCs生物學(xué)特性,能夠滿足進(jìn)一步研究和應(yīng)用的需要。
　　2.本研究中設(shè)計(jì)并制備了適于體內(nèi)培養(yǎng)ADSCs的生物反應(yīng)器,通過(guò)物理測(cè)試、小分子滲透測(cè)試、細(xì)胞滲透實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)生存測(cè)試,證實(shí)該生物反應(yīng)器能夠有效保障ADSCs在體內(nèi)生存所需的條件。
　　3.通過(guò)對(duì)比體內(nèi)和體外培養(yǎng)ADSCs的生物學(xué)特性和干性基因OCT4、NANOG、SOX2的表達(dá),證實(shí)體內(nèi)微環(huán)境更有利于維持干細(xì)胞干

8、性。
　　4.采用納升級(jí)超高壓液相色譜和電噴霧質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)生物反應(yīng)器內(nèi)體液進(jìn)行分析,和常規(guī)培養(yǎng)基進(jìn)行對(duì)比,篩選差異蛋白,初步認(rèn)為IGFs可能是影響分化潛能的因素之一。
　　5.本實(shí)驗(yàn)中,將rhVEGF165轉(zhuǎn)染到第3代穩(wěn)定生長(zhǎng)的ADSCs,并通過(guò)生物反應(yīng)器植入體內(nèi),經(jīng)分子生物學(xué)和組織病理學(xué)檢測(cè)證實(shí),ADSCs作為外源性rhVEGF165基因治療平臺(tái)更有利于發(fā)揮體內(nèi)緩釋作用,促進(jìn)皮下組織血管的生成。
　　6.通過(guò)共培養(yǎng)