低溫脅迫對(duì)甘蔗幼苗根系生長(zhǎng)代謝的影響和相關(guān)基因α-tubulin的功能研究.pdf

1、甘蔗（Saccharum officenarum L.）是中國(guó)乃至世界第一大糖料作物，也是重要的能源作物。甘蔗是喜溫作物，廣泛種植于熱帶和亞熱帶地區(qū)，需要適宜的溫度和濕度才能正常生長(zhǎng)。近年來(lái)，世界氣候變化異常，極端低溫頻發(fā)，寒害、凍害增多，給甘蔗生產(chǎn)造成巨大的損失。因此，開(kāi)展甘蔗抗寒機(jī)制的研究具有重要的意義。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)甘蔗低溫脅迫下根系的形態(tài)、解剖、生理生化代謝和分子水平等方面研究的綜合報(bào)道較少，本研究對(duì)甘蔗幼苗進(jìn)行低溫脅迫處理，從

2、根系形態(tài)、細(xì)胞亞顯微結(jié)構(gòu)、生理生化代謝水平與常溫下生長(zhǎng)的甘蔗進(jìn)行比較分析，以期探討低溫脅迫下甘蔗根系的生長(zhǎng)、生理生化特性以及相關(guān)基因等指標(biāo)與抗寒性的關(guān)系;并對(duì)甘蔗微管蛋白α-tubulin基因進(jìn)行克隆和表達(dá)分析，同時(shí)對(duì)該蛋白進(jìn)行原核表達(dá)、純化并制備單克隆抗體;利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法在煙草和甘蔗上進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，初步驗(yàn)證α-tubulin基因在植物耐寒性等的功能。主要的研究?jī)?nèi)容與結(jié)果如下:
　　1.低溫抑制了根系的生長(zhǎng)。與正常條件生長(zhǎng)的對(duì)照

3、根系相比，低溫脅迫下的根系表現(xiàn)根尖發(fā)黃，褐化，壞死;根長(zhǎng)和根體積的增加量均顯著低于對(duì)照;兩個(gè)甘蔗品種（ROC22和GT28）的生物量均比對(duì)照明顯降低，但根冠比差異不顯著;兩個(gè)品種相比較，發(fā)現(xiàn)ROC22地上部和地下部受低溫影響顯著高于GT28;超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果顯示:低溫脅迫導(dǎo)致根尖細(xì)胞由方變圓，結(jié)構(gòu)紊亂，細(xì)胞器減少，細(xì)胞膜破壞，細(xì)胞核解體，線粒體內(nèi)嵴模糊，逐漸成為空泡狀，部分溶解，ROC22細(xì)胞和細(xì)胞器受傷害程度大于GT28。
　　

4、2.低溫明顯影響甘蔗根系蛋白質(zhì)、糖含量以及蛋白酶活性。在低溫脅迫下，ROC22可溶性蛋白質(zhì)先略微上升后下降，GT28可溶性蛋白質(zhì)先升高后下降再升高，且保持在較高水平;ROC22氨基酸含量表現(xiàn)為先升高后降低，在第5和9d顯著低于對(duì)照，而GT28的氨基酸含量則始終高于對(duì)照。ROC22的可溶性糖和非可溶性糖含量逐漸下降，與對(duì)照差異顯著，而GT28中可溶性糖逐漸上升，并高于對(duì)照組，但非可溶性糖含量則先上升后下降。根系中肽鏈內(nèi)切酶活性先升高后下降

5、，在弱酸性條件活性高于堿性條件下，并且GT28活性普遍高于ROC22;羧肽酶和氨肽酶在短時(shí)間低溫下變化不顯著，但在第9d時(shí)ROC22羧肽酶活性激增，氨肽酶活性速降，GT28中這兩個(gè)酶活性變化不顯著。
　　3.成功構(gòu)建pET30a(+)-α-tubulin原核表達(dá)載體，利用IPTG誘導(dǎo)產(chǎn)生融合蛋白，原核表達(dá)結(jié)果顯示重組的pET30a(+)-α-tubulin為49.6kDa。重組蛋白通過(guò)Ni2+-NTA柱親和層析純化和透析濃縮后制備

6、單克隆抗體，用ELISA法檢測(cè)α-tubulin單克隆的效價(jià)，結(jié)果表明本研究所制備的α-tubulin單克隆抗體的效價(jià)高于1∶512000。用WesternBlot檢測(cè)甘蔗α-微管蛋白獲得了特異性的條帶，說(shuō)明甘蔗α-微管蛋白單克隆抗體己被成功制備。
　　4.利用qRT-PCR技術(shù)分析了α-tubulin基因在甘蔗中轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)，結(jié)果表明α-tubulin基因在甘蔗莖中的表達(dá)量最高，根中次之，葉中最少。低溫脅迫下，α-tubuli

7、n基因在根、莖和葉中的表達(dá)量是先升高后降低，最后差異逐漸減小。利用Western Blot方法檢測(cè)α-tubulin基因在甘蔗中蛋白質(zhì)水平的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)ROC22根中α-微管蛋白表達(dá)逐漸下降，而GT28中α-微管蛋白先升高后下降，但都高于對(duì)照。
　　5.成功構(gòu)建了煙草表達(dá)載體pBI121-α-tubulin和甘蔗表達(dá)載體pCAMBIA3300-α-tubulin。將分別受CaMV35S和Ubi啟動(dòng)子控制的pBI121-α-tubul

8、in和pCAMBIA3300-α-tubulin通過(guò)運(yùn)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入野生型煙草植株K346和甘蔗品種ROC22，經(jīng)PCR檢測(cè)和GFP觀察以及Bar基因檢測(cè)確證獲得轉(zhuǎn)基因煙草和甘蔗。
　　6.對(duì)轉(zhuǎn)α-tubulin基因煙草進(jìn)行低溫脅迫的功能驗(yàn)證。野生型和轉(zhuǎn)基因煙草分別進(jìn)行28℃（常溫）和0-4℃（低溫）處理，結(jié)果表明:低溫脅迫對(duì)野生型和轉(zhuǎn)基因型煙草葉綠素含量影響不顯著。常溫下，轉(zhuǎn)基因煙草凈光合作用顯著高于野生型煙草，Pn、Gs、

9、Tr顯著高于野生型，而Ci顯著低于野生型煙草。低溫脅迫下，野生型和轉(zhuǎn)基因煙草的光合作用受到抑制，并且都以呼吸作用為主，由強(qiáng)變?nèi)鹾蠓€(wěn)定。低溫下，滲透物質(zhì)可溶性蛋白質(zhì)、可溶性糖和脯氨酸含量在轉(zhuǎn)基因煙草中比野生型煙草中穩(wěn)定。保護(hù)酶系統(tǒng)SOD和POD活性先升高后下降，但野生型煙草變化幅度顯著高于轉(zhuǎn)基因煙草;野生型煙草CAT活性逐漸下降，而轉(zhuǎn)基因煙草CAT活性先下降后激增。說(shuō)明α-tubulin的過(guò)量表達(dá)影響植物體內(nèi)生理生化特性。
　　7.

10、利用qRT-PCR技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)甘蔗α-tubulin基因的煙草進(jìn)行表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)α-tubulin基因在兩種基因型煙草葉脈中表達(dá)最高，莖中次之，葉中最低;轉(zhuǎn)基因煙草葉和莖中α-tubulin基因表達(dá)顯著高于野生型煙草，而葉脈中α-tubulin基因表達(dá)低于野生型煙草。低溫脅迫下，野生型煙草葉片中α-tubulin基因表達(dá)逐漸降低，而轉(zhuǎn)基因煙草葉片中α-tubulin基因表達(dá)有升有降，但顯著高于野生型煙草。WesternBlot檢測(cè)α-tub