角膜移植排斥反應(yīng)相關(guān)的淚液蛋白組學(xué)研究.pdf

1、第一章:大鼠角膜移模型的建立和排斥反應(yīng)相關(guān)蛋白組學(xué)分析
　　目的：
　　建立大鼠自體移植模型和異體移植模型，通過(guò)同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量技術(shù)(iTRAQ)為基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究篩選出與角膜移植排斥發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的差異蛋白，并運(yùn)用生物信息學(xué)技術(shù)，分析其與角膜移植排斥反應(yīng)可能相關(guān)的機(jī)制，為進(jìn)一步發(fā)展新的排斥反應(yīng)監(jiān)測(cè)、預(yù)防、治療手段奠定基礎(chǔ)。
　　材料和方法：
　　1.成年Wistar大鼠42只，隨機(jī)分為三組，分別對(duì)右

2、眼行同種異基因角膜移植（SD大鼠為供體，Wistar大鼠為受體），同種同基因角膜移植（自體原位角膜移植）及空白對(duì)照。
　　2.術(shù)后每天觀察植片水腫、渾濁和新生血管情況。
　　3.術(shù)后2、7、14天收集各組大鼠淚液，每只約10μl，凍存于80℃以備后用。
　　4.將大鼠淚液樣本離心后取上清液，經(jīng)多重吸附去除系統(tǒng)(MARS)去除高豐度蛋白。然后對(duì)這些淚液標(biāo)本進(jìn)行蛋白提取、定量和酶解。
　　5.iTRAQ八標(biāo)試劑標(biāo)記后

3、（113標(biāo)記空白對(duì)照組，115標(biāo)記異體移植組2d，116標(biāo)記異體移植組7d，117標(biāo)記異體移植組14d，118標(biāo)記自體移植組2d，119標(biāo)記自體移植組7d，121標(biāo)記自體移植組14d），進(jìn)行二維液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(2DLC-MS/MS)分析。
　　6.利用ProteinPilot軟件進(jìn)行搜庫(kù)并定量。差異表達(dá)蛋白界值設(shè)定:大于2為顯著上調(diào)(p＜0.05)，小于0.5為顯著下調(diào)(p＜0.05)。
　　7.觀察各組間蛋白表達(dá)的差異

4、和各組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)蛋白表達(dá)的差異。對(duì)各組和各時(shí)間點(diǎn)差異表達(dá)的蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，包括分層聚類分析、GO分析和通路分析，尋找角膜移植排斥反應(yīng)相關(guān)的差異蛋白。
　　結(jié)果：
　　1.角膜移植術(shù)后，除術(shù)后2天兩組大鼠角膜植片渾濁度沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異外(p=0.123)，其余角膜植片在各時(shí)間點(diǎn)渾濁、水腫、新生血管及RI值差異有顯著性(p＜0.05)。
　　2.共鑒定出iTRAQ標(biāo)記的差異蛋白277個(gè)。在異體移植組中2d、7d、1

5、4d這三個(gè)時(shí)間點(diǎn)發(fā)生顯著上調(diào)/下調(diào)的蛋白分別為:35個(gè)、36個(gè)、31個(gè)。
　　3.在異體移植組中，GO分析發(fā)現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)、自由基的清除、細(xì)胞的死亡與存活、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)富集度較高;pathway分析顯示LXR/RXR的活化、急性時(shí)相反應(yīng)信號(hào)通路、網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用信號(hào)通路和肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架信號(hào)通路富集度較高。與自體移植相比，異體移植富集度顯著增高的通路有:LXR/RXR的活化通路、網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用信號(hào)通路。
　　4.C

6、oronin-1A在異體移植組中明顯高于自體移植組。在異體移植組中，其在排斥開(kāi)始發(fā)生時(shí)即7d達(dá)到峰值，而在自體移植組中，其隨時(shí)間推移逐漸降低。
　　5.Vitamin-D binding protein(DBP)在移植組第14天明顯上調(diào)。
　　結(jié)論：
　　1.Itraq為我們從整體上了解角膜移植排斥發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中蛋白質(zhì)的差異表達(dá)，從而篩選出有意義的蛋白提供了良好的平臺(tái)。對(duì)樣本量小、極性蛋白、及酸性堿性蛋白具有很高的檢

7、出率，可信度高，可重復(fù)性強(qiáng)。淚液樣本的收集對(duì)眼局部和全身無(wú)影響。由于淚液樣本量較少，選用itraq技術(shù)對(duì)淚液中蛋白質(zhì)的檢測(cè)具有很高的效率。
　　2.生物信息學(xué)的方法可以擴(kuò)展思路和視野，有助于我們進(jìn)一步從整體上了解差異表達(dá)蛋白的功能和調(diào)控。本研究提示參與神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)的蛋白與植片的排斥相關(guān)，而參與氧自由基的活化的蛋白與角膜內(nèi)皮細(xì)胞凋亡以及白細(xì)胞積聚、免疫損傷和新生血管的形成相關(guān)。LXR/RXR通路可能通過(guò)影響脂質(zhì)代謝、葡萄糖代謝和巨噬

8、細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)影響植片的存活。肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架信號(hào)通路參與免疫細(xì)胞的趨化移行、抗原識(shí)別、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫突觸形成、活化、增殖分裂等過(guò)程，從而影響免疫排斥反應(yīng)。
　　3.Coronin-1A可能是排斥發(fā)生早期有意義的生物學(xué)標(biāo)記物，它通過(guò)影響T細(xì)胞的遷移和T細(xì)胞與APCs相互作用參與排斥反應(yīng)的發(fā)生。
　　4.DBP可能通過(guò)影響巨噬細(xì)胞活化和趨化參與角膜移植排斥反應(yīng)。
　　第二章抗排斥藥物干預(yù)對(duì)于角膜移植排斥反應(yīng)相關(guān)蛋白表達(dá)

9、的影響
　　目的：
　　通過(guò)iTRAQ蛋白組學(xué)技術(shù)，觀察抗排斥藥物地塞米松和環(huán)孢素(CsA)對(duì)大鼠角膜移植模型淚液中蛋白質(zhì)的影響，并運(yùn)用生物信息學(xué)技術(shù)，分析差異表達(dá)的蛋白在角膜移植排斥發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制。
　　方法：
　　1.成年Wistar大鼠28只，隨機(jī)分為2組，對(duì)右眼行同種異基因角膜移植(SD大鼠為供體，Wistar大鼠為受體)。術(shù)后兩組分別給予地塞米松眼水和CsA眼水，觀察植片排斥情況?？瞻讓?duì)照組wi

10、star大鼠14只。
　　2.術(shù)后2、7、14天收集各組大鼠淚液，每只約10μl，凍存于80℃以備后用。
　　3.iTRAQ八標(biāo)試劑標(biāo)記（114標(biāo)記對(duì)照組;115標(biāo)記環(huán)孢素2d;116標(biāo)記環(huán)孢素7d;117標(biāo)記環(huán)孢素14d;118標(biāo)記地塞米松2d;119標(biāo)記地塞米松7d;121標(biāo)記地塞米松14d）。其余操作同第一章。
　　結(jié)果：
　　1.用藥組除第2天外，其他時(shí)間點(diǎn)RI均低于未用藥組。地塞米松組和CsA組之間RI

11、無(wú)明顯差異。
　　2.共鑒定出iTRAQ標(biāo)記的差異蛋白440個(gè)。
　　3.地塞米松組2天、7天、14天這三個(gè)時(shí)間點(diǎn)發(fā)生顯著上調(diào)/下調(diào)的蛋白分別為:36個(gè)、41個(gè)、9個(gè)。
　　4.環(huán)孢素組2天、7天、14天這三個(gè)時(shí)間點(diǎn)發(fā)生顯著上調(diào)/下調(diào)的蛋白分別為45個(gè)、49個(gè)、43個(gè)。
　　5.對(duì)地塞米松組進(jìn)行GO分析發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的死亡與存活，皮膚疾病，蛋白合成，神經(jīng)系統(tǒng)疾病等有關(guān)的生物學(xué)過(guò)程富集程度較高，pathway分析顯示顯示

12、EIF2信號(hào)通路、LXR/RXR活化信號(hào)通路、網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用信號(hào)通路、急性期反應(yīng)信號(hào)通路富集度較高。與未用藥移植組相比，LXR/RXR活化信號(hào)通路、網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用信號(hào)通路、急性期反應(yīng)信號(hào)通路和肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架信號(hào)通路均有不同程度的下降。
　　6.對(duì)環(huán)孢素組進(jìn)行GO分析發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的死亡與生存、蛋白合成、皮膚疾病、免疫性異常等富集度較高，pathway分析顯示顯示LXR/RXR活化通路、EIF2信號(hào)通路、網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)

13、吞作用信號(hào)通路、急性期反應(yīng)信號(hào)通路富集度較高。與未用藥移植組相比，網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用信號(hào)通路、急性期反應(yīng)信號(hào)通路、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架信號(hào)通路的富集度均有不同程度下降。
　　7.coronin-1A上調(diào)的程度明顯低于未用藥組（未用藥組:2d=5.75，7d=8.24，14d=4.29;地塞米松組:2d=5.86，7d=1.63，14d=1.55; CsA組:2d=3.80，7d=3.40，14d=3.02)。
　　8.DBP

14、在用藥組顯著低于未用藥組。
　　結(jié)論：
　　1.EIF2信號(hào)通路可促進(jìn)角膜內(nèi)皮細(xì)胞的一些損傷修復(fù)機(jī)制，從而使其能夠更好的跨過(guò)細(xì)胞阻滯，抵抗凋亡。
　　2.急性時(shí)相蛋白與角膜移植排斥的發(fā)生密切相關(guān)。與未用藥組相比，其在用藥組中明顯降低，提示急性時(shí)相反應(yīng)蛋白還與與排斥的程度相關(guān)，因此，淚液中的急性時(shí)相蛋白可能可作為植片排斥的檢測(cè)指標(biāo)，指導(dǎo)臨床的早期診治和檢測(cè)療效。
　　3.抗排斥藥物可能通過(guò)降低coronin-1A的

15、表達(dá)，影響T細(xì)胞的遷移和T細(xì)胞與APCs相互作用，從而減輕角膜移植排斥反應(yīng)。
　　4.抗排斥藥物干預(yù)對(duì)于DBP有明顯影響，可以考慮DBP作為評(píng)價(jià)角膜移植術(shù)后預(yù)后的指標(biāo)。
　　第三章人淚液中角膜移植排斥反應(yīng)相關(guān)蛋白篩選及臨床應(yīng)用初探
　　目的：
　　應(yīng)用iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，對(duì)臨床PKP術(shù)后發(fā)生角膜移植排斥反應(yīng)和未發(fā)生角膜移植排斥反應(yīng)病人淚液中的蛋白質(zhì)組進(jìn)行檢測(cè)，以求在動(dòng)物模型的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步深入研究探索角膜移

16、植排斥的發(fā)生機(jī)制，并發(fā)現(xiàn)新的生物學(xué)標(biāo)記物，為排斥發(fā)生的早期診治和新藥的開(kāi)發(fā)提供新思路。
　　材料與方法
　　1.穿透性角膜移植術(shù)后，發(fā)生急性排斥的患者10例，簡(jiǎn)稱排斥組，收集其淚液;穿透性角膜移植術(shù)后（＞2周）未發(fā)生排斥的患者10例，簡(jiǎn)稱未排斥組。排斥組和未排斥組術(shù)后按常規(guī)局部或全身使用糖皮質(zhì)激素、環(huán)孢素A以預(yù)防術(shù)后排斥。
　　2.排斥組患者在臨床診斷為角膜移植排斥反應(yīng)時(shí)收集基礎(chǔ)淚液，未排斥組于術(shù)后＞2周采集。淚液樣本

17、置于-80℃保存。
　　3.iTRAQ四標(biāo)標(biāo)記:117未排斥組;121排斥組。差異表達(dá)蛋白界值設(shè)定:大于1.3為顯著上調(diào)(p＜0.05)，小于0.77為顯著下調(diào)(p＜0.05)。其余操同第一章相關(guān)內(nèi)容。
　　4.利用Ingenuity生物通路分析軟件分析所鑒定蛋白間的交互作用。
　　結(jié)果：
　　1.發(fā)生排斥的10例患者中，包括4名角膜白斑、3名病毒性角膜炎、1名真菌性角膜炎、1名角膜穿孔和一名未規(guī)律用藥的圓錐角膜

18、。
　　2.共鑒定出iTRAQ標(biāo)記的蛋白428個(gè)。顯著變化的差異蛋白7個(gè)，上調(diào)的有叢生蛋白(Clusterin)、富含脯氨酸蛋白4(proline-rich protein4)和α-淀粉酶2B(α-amylase2B)，下調(diào)的有脂鈣蛋白-1（lipocalin-1）、細(xì)胞外糖蛋白(extracellular glycoprotein lacritin)、血清白蛋白(serum albumin)和轉(zhuǎn)錄因子7（transcriptio

19、n factor7-like1）。
　　3.GO分析結(jié)果顯示細(xì)胞間的相互作用、cell compromise、器官損傷和異常等功能的富集度較高;pathway分析顯示LXR/RXR活化信號(hào)通路、原發(fā)免疫缺陷信號(hào)通路和急性期反應(yīng)信號(hào)通路的富集度較高。
　　4.IPA分析發(fā)現(xiàn)盡管泛素結(jié)合酶(ubiquitin conjugation enzyme，UBC)未被iTRAQ檢測(cè)出，但是UBC與多種鑒定出的角膜移植排斥相關(guān)蛋白發(fā)生作用

20、。
　　結(jié)論：
　　1.角膜移植排斥發(fā)生的高危因素主要包括炎癥、角膜新生血管化、角膜新生淋巴管化、反復(fù)移植、大植片或不規(guī)則植片、感染和病毒復(fù)制（主要見(jiàn)于單皰病毒性角膜炎）。此外，即使在低危病人中，如不規(guī)律用藥，排斥風(fēng)險(xiǎn)也會(huì)明顯升高。
　　2.叢生蛋白、富含脯氨酸蛋白4、α-淀粉酶2B和脂鈣蛋白-1可能為角膜移植排斥反應(yīng)的生物學(xué)標(biāo)志物。
　　3.泛素結(jié)合酶(UBC)可能為多種排斥相關(guān)蛋白的上游分子，通過(guò)調(diào)控下游目標(biāo)