寄生蜂對棉鈴蟲凝集素和溶血素的調(diào)控及寄主新免疫因子的鑒定.pdf

1、本文以我國重要農(nóng)作物害蟲棉鈴蟲Helicoverpa armigera與其優(yōu)勢種幼蟲內(nèi)寄生蜂棉鈴蟲齒唇姬蜂Campoletis chlorideae為寄生體系，研究了寄生蜂C.chlorideae寄生對寄主H. armigera血淋巴免疫識別因子C-型凝集素和溶血素的調(diào)控和誘導(dǎo)。并對寄主棉鈴蟲唾液（反吐液）中新發(fā)現(xiàn)的免疫相關(guān)物質(zhì)凝集素和溶血素進(jìn)行了識別和初步鑒定。進(jìn)一步，對分別來自棉鈴蟲血淋巴和唾液中的溶血素進(jìn)行了理論特性的研究，以期為

2、深入研究其分子結(jié)構(gòu)和生理功能提供依據(jù)。主要結(jié)果如下：
　　一、棉鈴蟲齒唇姬蜂寄生對棉鈴蟲凝集活性和C-型免疫凝集素基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控
　　為探明內(nèi)寄生蜂成功調(diào)控寄主免疫反應(yīng)的分子基礎(chǔ)。本文通過棉鈴蟲齒唇姬蜂和寄主棉鈴蟲這一寄生體系，研究寄生對寄主幼蟲生長發(fā)育、血淋巴蛋白和凝集活性，以及8個C-型凝集素基因轉(zhuǎn)錄水平等的影響。結(jié)果表明：寄生顯著抑制棉鈴蟲幼蟲的生長發(fā)育，導(dǎo)致血淋巴蛋白含量顯著提高，出現(xiàn)多條寄生特異蛋白。凝集素作為重要

3、的體液免疫因子，在棉鈴蟲發(fā)育的不同時期均有表達(dá)，且隨蟲齡增大活性增強(qiáng)。寄生蜂寄生后第2 d和6 d，被寄生幼蟲血淋巴凝集素活性分別是未被寄生幼蟲的4和8倍。在棉鈴蟲不同發(fā)育期，8個C-型凝集素的表達(dá)特性存在明顯差異，從末齡幼蟲的取食期到游走期，凝集素基因 HaCTL1、HaCTL3、HaCTL4和HaCTL5的mRNA轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，而HaCTL2和HaCTL7卻出現(xiàn)下調(diào)。該結(jié)果表明這些凝集素基因的轉(zhuǎn)錄水平與昆蟲的生長發(fā)育密切相關(guān)即受激素

4、的調(diào)控。組織特異性研究表明，8個C-型凝集素主要在血細(xì)胞和脂肪體中表達(dá)，此外，在中腸、表皮、馬氏管、精巢和唾腺中也有表達(dá)，但不同基因在不同組織中的表達(dá)特性存在顯著差異。寄生蜂寄生對這些凝集素基因的轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控明顯不同，在寄生后第4 d，8個凝集素中除HaCTL6外均被顯著抑制，這表明 C-型凝集素參與了寄主昆蟲和寄生蜂間的免疫與免疫抑制作用。本研究提供了寄生蜂寄生對寄主免疫凝集素調(diào)控的信息，可以增強(qiáng)目前我們對于寄生蜂成功寄生的認(rèn)識，為

5、更好的利用寄生蜂防治棉鈴蟲奠定基礎(chǔ)。
　　二、棉鈴蟲齒唇姬蜂寄生誘導(dǎo)棉鈴蟲血淋巴溶血因子的高表達(dá)
　　溶血素或溶血因子（Hemolysin，hemolytic factor）在無脊椎動物中普遍存在，因其具有溶解異物的特性而備受關(guān)注，是重要的體液免疫因子。無脊椎動物對入侵病原物的溶解是其先天免疫的一種主要形式，但目前對植食性昆蟲中是否存在溶血因子尚無詳細(xì)報道。為此，本文綜合運(yùn)用了4種溶血檢測法即V底微量反應(yīng)板、顯微鏡觀察、瓊脂

6、糖平板溶血斑和分光光度法分別測試了多食性昆蟲棉鈴蟲幼蟲血淋巴對脊椎動物雞、鴨和兔血紅細(xì)胞的溶血活性，以充足的的證據(jù)表明在棉鈴蟲幼蟲血淋巴中存在有溶血活性物質(zhì)。進(jìn)一步，通過硫酸銨鹽析、透析初步分離出具有溶血活性的物質(zhì)，表明其為蛋白質(zhì)。此外，除幼蟲期，在棉鈴蟲卵、蛹和成蟲中也發(fā)現(xiàn)有溶血素。幼蟲蟲齡不同表現(xiàn)出明顯的溶血活性差異，且幼蟲取食期溶血活性明顯高于蛻皮期或蛻皮初期。溶血素在棉鈴蟲的多個組織中均有分布，如唾腺、脂肪體、表皮、中腸和精巢，

7、而唾腺和脂肪體的溶血活性最高。棉鈴蟲齒唇姬蜂寄生后第2 d，被寄生棉鈴蟲幼蟲血淋巴溶血活性比未被寄生幼蟲的活性提高了3.4倍。該結(jié)果表明棉鈴蟲幼蟲血淋巴中存在的溶血活性物質(zhì)能夠被寄生蜂寄生所誘導(dǎo)。注射大腸桿菌12和24 h后，棉鈴蟲幼蟲血淋巴溶血活性顯著提高。由此推斷，該溶血因子是可誘導(dǎo)的或是從頭合成的，這意味著該溶血因子與寄主昆蟲的免疫反應(yīng)相關(guān)，可能通過抑制或清除入侵的病原物或寄生物來實(shí)施免疫防御。
　　三、棉鈴蟲唾液（反吐液）

8、中新凝集素和溶血素的識別與初步鑒定
　　凝集素作為模式識別受體，在異物識別中發(fā)揮重要作用。棉鈴蟲血淋巴中含有至少8種凝集素，但對其唾液（口腔反吐物）是否存在識別異物的凝集素卻從未涉及。本文通過V底微量反應(yīng)板檢測到棉鈴蟲唾液含有凝集活性物質(zhì)。在相差顯微鏡下，可觀察到唾液使雞血紅細(xì)胞發(fā)生明顯的凝集現(xiàn)象。經(jīng)硫酸銨鹽析，35％和45%硫酸銨沉淀出的蛋白具有明顯的凝集活性，表明其為蛋白質(zhì)。通過糖抑制試驗，發(fā)現(xiàn)棉鈴蟲唾液凝集素與血淋巴凝集素的

9、糖結(jié)合譜存在差異，表明他們是不同的凝集素種類。此外，利用不同脊椎動物紅細(xì)胞通過 V底微量反應(yīng)板、顯微鏡觀測、瓊脂糖平板溶血斑和分光光度法4種溶血活性檢測方法，證實(shí)了棉鈴蟲幼蟲唾液中存在溶血活性物質(zhì)，它的溶血活性遠(yuǎn)高于同體積血淋巴的活性。低齡幼蟲溶血活性略高于高齡幼蟲。且在供試的亞洲玉米螟Ostrinia furnacalis、甜菜夜蛾Spodoptera exigua、二點(diǎn)委夜蛾P(guān)roxenus lepigone、菜青蟲Pieris r

10、apae等鱗翅目昆蟲中普遍存在。但是，溶血活性存在差異。如二點(diǎn)委夜蛾溶血活性最高，棉鈴蟲次之，玉米螟、甜菜夜蛾和菜青蟲唾液溶血活性相對最低。取食的食物對棉鈴蟲唾液溶血活性也產(chǎn)生影響，如取食人工飼料飼養(yǎng)的棉鈴蟲幼蟲唾液溶血活性最高，辣椒次之，甘藍(lán)最低。進(jìn)一步，對唾液溶血素的發(fā)生來源進(jìn)行了分析，中腸液溶血活性最高，唾液和前腸液溶血活性次之，而后腸液溶血活性最低；對相應(yīng)組織研磨液溶血活性分析發(fā)現(xiàn)，唾腺研磨液溶血活性最高，前腸和中腸次之，后腸組

11、織研磨液只有極低的溶血活性，由此判斷唾腺和中腸是其可能的來源。唾液經(jīng)硫酸銨鹽析、透析后，同樣獲得了具有溶血活性的物質(zhì)，表明其為蛋白質(zhì)。利用不同脊椎動物紅細(xì)胞進(jìn)行交叉吸附試驗，發(fā)現(xiàn)它對不同紅細(xì)胞種類的溶血活性以兔紅細(xì)胞最強(qiáng)，且紅細(xì)胞吸附后的唾液溶血活性被明顯抑制。進(jìn)一步，用制備的紅細(xì)胞膜吸附處理唾液樣品，通過 SDS-PAGE電泳，篩選具有與膜結(jié)合并具有溶血活性的蛋白，共獲得分子量48 kDa、28 kDa和23 kDa的差異蛋白條帶。利

12、用ESI質(zhì)譜鑒定，從中篩選出革蘭氏陰性菌結(jié)合蛋白和肽聚糖識別蛋白，其分子量分別為42.0 kDa和20.1kDa，等電點(diǎn)pI分別為5.85和5.71。除此之外，還有一些酶類。由此推斷棉鈴蟲唾液中的溶血素可能與識別和溶解病原細(xì)菌有關(guān)。
　　四、棉鈴蟲血淋巴溶血素的理化特性
　　為深入研究棉鈴蟲血淋巴新發(fā)現(xiàn)的免疫因子溶血素的分子結(jié)構(gòu)和生理功能，明確其分離、純化的理化條件非常重要。本文分別就溫度、pH、EDTA和金屬離子對該溶血素

13、的影響及其糖結(jié)合特性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：棉鈴蟲血淋巴溶血素?zé)岱€(wěn)定性較差，在50℃時，溶血活性顯著下降，60℃時，溶血活性即完全喪失，屬熱不穩(wěn)定型。血淋巴溶血素反應(yīng)濃度與溶血活性并不成正比，8倍稀釋液的溶血活性反高于4倍稀釋液，但隨稀釋倍數(shù)增加，32倍及以上稀釋倍數(shù)的血淋巴無溶血活性。血淋巴與紅細(xì)胞在反應(yīng)前60 min內(nèi)，溶血百分率無明顯變化，反應(yīng)2 h后，對紅細(xì)胞溶解速度急劇加快，6 h溶血效能最大。血淋巴溶血活性的最適pH為7-8。

14、濃度62.5、125、250和500 mM EDTA對血淋巴溶血活性具有促進(jìn)作用，而金屬離子Mn2+、Zn2+、Co2+和Ca2+卻具有極顯著的抑制作用。糖抑制試驗結(jié)果表明：D-乳果糖、棉子糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、乳糖、海藻糖、對硝基苯-β-D-半乳糖吡喃糖苷（PNPG）和唾液酸均未對血淋巴溶血活性產(chǎn)生抑制作用，說明棉鈴蟲血淋巴溶血素與上述糖沒有結(jié)合位點(diǎn)。
　　五、棉鈴蟲唾液（反吐液）溶血素的理化特性
　　探明棉鈴蟲唾液

15、（反吐液）中溶血素的理化特性，可為深入研究棉鈴蟲的免疫防御機(jī)制提供依據(jù)。采用雞血紅細(xì)胞對棉鈴蟲唾液進(jìn)行溶血活性測定，研究溫度、濃度、作用時間、pH、EDTA和金屬離子等理化因子對其溶血活性的影響，通過糖抑制試驗分析其結(jié)合特性，并以蜜蜂蜂毒溶血肽的特性進(jìn)行對比研究。結(jié)果表明：在45℃、50℃條件下，棉鈴蟲唾液溶血素的溶血活性升高，在60℃-100℃活性降低，但溶血活性依然可達(dá)最大溶血活性的67.5%，說明其具有一定的熱穩(wěn)定性。與之相比，蜂

16、毒溶血肽熱穩(wěn)定性極強(qiáng)，在100℃下，溶血活性保持不變。唾液樣品在稀釋16倍時溶血活性達(dá)最高，是未經(jīng)稀釋原液溶血活性的1.6倍，而蜂毒樣品在稀釋1-32倍之間，溶血活性變化不明顯。唾液溶血素與紅細(xì)胞在反應(yīng)5-15 min之間，對紅細(xì)胞溶解速率最大。蜂毒樣品在35 min-1 h和2-6 h出現(xiàn)兩次紅細(xì)胞快速溶解。唾液溶血素具有廣泛的pH耐受度，在pH2-10，溶血活性沒有變化。唾液經(jīng)125、250和500 mM EDTA處理后，溶血活性顯

17、著升高，而蜂毒只在500 mM EDTA下溶血活性顯著提高，62.5、125、250和1000 mM EDTA下溶血活性反被顯著抑制。金屬離子Mn2+、Zn2+、Co2+、Ca2+和 Ni2+抑制唾液溶血素活性，而 K+和 Mg2+對唾液溶血素活性具有促進(jìn)作用。對于蜂毒，Mn2+、Zn2+、Co2+和Ni2+能夠顯著抑制其溶血活性。糖抑制試驗結(jié)果表明，測試的D-乳果糖、PNPG、棉籽糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、乳糖、海藻糖和唾液酸對唾液