VEGF-C及其受體NRP-2對血清剝奪誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞凋亡與自噬的作用研究.pdf

1、目的：探討血管內(nèi)皮生長因 C(VEGF-C)在腎缺血再灌注動物模型中表達的變化以及VEGF-C及其受體NRP-2對血清剝奪誘導(dǎo)的大鼠近端腎小管上皮細胞（NRK52E）凋亡和自噬的作用及機制。
　　方法：（1）觀察小鼠腎缺血再灌注模型中VEGF-C的表達變化：構(gòu)建小鼠腎缺血再灌注模型，收集并檢測各組血清總Scr，BUN的水平，PAS染色觀察腎臟的病理損傷程度，免疫組織化學法及Western Blot檢測VEGF-C的表達與分布。（2

2、）觀察VEGF-C及受體 NRP-2對血清剝奪誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞凋亡的影響：血清剝奪不同時間刺激NRK52E細胞，Western Blot檢測血清剝奪不同時間點激活型caspase3和總caspase3的表達變化；用小分子siRNA干擾技術(shù)分別沉默VEGF-C,NRP-2的表達，利用流式細胞學方法檢測VEGF-C,NRP-2沉默對血清剝奪誘導(dǎo)細胞凋亡率的影響，Western Blot檢測抗凋亡蛋白Bcl-2的表達變化；用不同濃度的重組

3、VEGF-C因子預(yù)處理細胞，利用CCK-8法檢測外源性加入VEGF-C對血清剝奪誘導(dǎo)的細胞活性改變的影響。（3）觀察VEGF-C及受體NRP-2對血清剝奪誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞自噬的影響：血清剝奪不同時間刺激NRK52E細胞，Western Blot檢測血清剝奪不同時間點LC3的表達；細胞免疫熒光檢測LC3表達及分布情況；透射電鏡觀察血清剝奪誘導(dǎo)后細胞的超微結(jié)構(gòu)形態(tài)改變；用小分子siRNA干擾技術(shù)分別沉默VEGF-C,NRP-2的表達，W

4、estern Blot檢測VEGF-C,NRP-2沉默對血清剝奪誘導(dǎo)LC3的表達變化的影響；在血清剝奪的條件下，加入不同濃度的巴伐洛霉素A1（Bafilomycin A1）,CCK-8法檢測細胞活性的改變；Western Blot檢測加入Bafilomycin A1后VEGF-C沉默對血清剝奪誘導(dǎo)LC3的表達變化的影響。
　　結(jié)果：（1）缺血再灌注損傷后，小鼠血肌酐和尿素氮上升，缺血再灌注24 h時腎功能損傷最明顯，而缺血再灌注4

5、8 h時腎功能已經(jīng)有部分恢復(fù)。與假手術(shù)組比較，缺血再灌注損傷后腎組織可見腎小管管腔擴張，伴管型形成，腎小管上皮細胞腫脹壞死及空泡變性，刷狀緣壞死脫落，并且伴有炎性細胞侵潤，而腎小球未見明顯的病變。免疫組織化學結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，缺血再灌注24 h組小鼠腎臟VEGF-C表達增加，并且主要表達在腎臟皮髓質(zhì)交界處及髓質(zhì)部的腎小管。Western blot結(jié)果顯示隨著缺血后再灌注時間的延長，小鼠腎組織 VEGF-C蛋白的表達逐漸增加。（2

6、）隨著血清剝奪時間的延長，細胞激活型caspase3的表達增高，而總caspase3的表達減少；利用siRNA技術(shù)分別沉默NRK52E細胞VEGF-C和NRP-2的表達后，血清剝奪誘導(dǎo)的細胞凋亡水平均明顯增加；血清剝奪刺激后，Bcl-2蛋白表達下降，而沉默VEGF-C能進一步降低Bcl-2蛋白的表達；外源性加入VEGF-C能抑制血清饑餓誘導(dǎo)的細胞活力下降。(3)隨著血清剝奪時間的延長，LC3II蛋白的表達逐漸增加；血清剝奪誘導(dǎo)后LC3在

7、胞漿點狀聚集增多；透射電鏡下觀察到血清剝奪誘導(dǎo)后細胞線粒體腫脹，細胞內(nèi)空泡變性顯著增多，并可以見到降解自噬囊泡；分別沉默VEGF-C和NRP-2的表達后，能進一步增加血清剝奪誘導(dǎo)的LC3II的蛋白表達；在血清剝奪環(huán)境下，Bafilomycin A1能使細胞活力進一步降低，并呈濃度依耐性；加入Bafilomycin A1后，VEGF-C干擾組的細胞LC3表達變化的比值均低于對照siRNA組。
　　結(jié)論：腎缺血再灌注損傷后腎臟組織中V