尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)GHSR和ghrelin基因多態(tài)性分析及其生長相關(guān)SNP標記的篩選.pdf

1、尼羅羅非魚吉富品系（Oreochromis niloticus，GIFT strain）目前是我國養(yǎng)殖區(qū)域產(chǎn)量最高、分布最廣的羅非魚品種，其生長速度顯著高于其他羅非魚養(yǎng)殖品種。研究表明，吉富尼羅羅非魚不同家系間或同一家系不同個體間的生長速度存在較大差異，且形態(tài)上也存在一定差異，說明群體內(nèi)具有豐富的遺傳多樣性，在遺傳上仍具有較大的選育空間。為了避免近親交配引起種質(zhì)衰退，保證吉富羅非魚快長優(yōu)良性狀的穩(wěn)定遺傳，也為了培育出生長速度更快的吉富羅

2、非魚品系，本研究把吉富尼羅羅非魚中兩個與機體生長調(diào)節(jié)密切相關(guān)的基因—生長激素促分泌素受體（Growth Hormone Secretagogue Receptor，GHSR）基因和和生長激素促分泌素（ghrelin）基因作為候選基因，通過基因克隆和序列多態(tài)性分析，初步獲得其SNPs位點，再對SNPs基因型與吉富尼羅羅非魚生長性狀的關(guān)聯(lián)性進行分析，擬從中找到吉富尼羅羅非魚生長相關(guān)SNPs分子標記，將其應(yīng)用于吉富尼羅羅非魚的分子輔助育種過程

3、中。本研究的結(jié)果如下：
　　1.尼羅羅非魚GHSR基因和ghrelin基因的克隆及其多態(tài)性分析
　　克隆獲得了尼羅羅非魚GHSRⅠa和GHSRⅠb的cDNA序列，其中GHSRⅠa cDNA序列全長為4060bp，包括5′非編碼區(qū)為1003bp、3′非編碼區(qū)為1905bp、編碼區(qū)為1152bp，該基因編碼384個氨基酸；GHSRⅠb cDNA序列全長為4268bp，包括5′非編碼區(qū)1003bp、3′非編碼區(qū)2371bp和編碼區(qū)

4、894bp，共編碼298個氨基酸。GHSRⅠa和GHSRⅠb氨基酸序列相似性為73.7％，它們位于N端的279個氨基酸完全相同。系統(tǒng)進化分析結(jié)果顯示：尼羅羅非魚GHSRⅠa和GHSRⅠb的氨基酸序列都與莫桑比克羅非魚（O.mossambicus）和荷那龍羅非魚（O.hornorum）中相應(yīng)氨基酸序列的親緣關(guān)系最近，與同屬于麗魚科的黑鯛（Sparus macrocephalus）聚為一大支，而與虹鱒（Oncorhynchus mykiss

5、）、建鯉（Cyprinus carpio var.Jian）及人類（Homo sapiens）中相應(yīng)的氨基酸序列的親緣關(guān)系較遠?？寺～@得了尼羅羅非魚GHSR基因組DNA片段3206bp，包括5′非編碼區(qū)1589 bp，3′非編碼區(qū)231 bp和編碼區(qū)1386 bp。編碼區(qū)包括1個內(nèi)含子和2個外顯子，根據(jù)mRNA的兩種不同剪接方式，分別編碼384個（GHSRⅠa）和298（GHSRⅠb）個氨基酸。尼羅羅非魚GHSR基因組序列與莫桑比克羅非

6、魚GHSR基因組序列（GenBank No:EU910220.1）相似性高達98.54%，與伯氏樸麗魚(Haplochromisburtoni) GHSR基因組序列（GenBank No:XM_005926046.1）相似性為88.70%。從尼羅羅非魚快長和基礎(chǔ)群體中獲得長度為2857bp的GHSR基因組DNA序列78條，共發(fā)現(xiàn)340個多態(tài)性位點（其中單核苷酸變異位點63個，簡約性信息位點277個）和39種單倍型，核酸多樣性（Pi）為0

7、.0217，平均核苷酸差異數(shù)（K）為57.923，單倍型多樣性（Hd）為0.00133；基礎(chǔ)群體GHSR基因的單核苷酸多態(tài)性位點數(shù)（SNP）、單倍型數(shù)目（H）、核苷酸多樣性（pi）、單倍型多樣性（Hd）平均核苷酸差異數(shù)（K）等遺傳參數(shù)的值都比快長群體中相應(yīng)值要高，說明尼羅羅非魚快長群體在選育的過程中導(dǎo)致該基因的遺傳多樣性降低。
　　從尼羅羅非魚快長和基礎(chǔ)群體中獲得長度為841bp的ghrelin基因組DNA序列77條，共發(fā)現(xiàn)38個

8、多態(tài)性位點（其中單核苷酸變異位點31個，簡約性信息位點7個）和13種單倍型，平均核苷酸差異數(shù)（K）為2.7717，核酸多樣性（Pi）為0.00402，單倍型多樣性（Hd）為0.722；快長群體ghrelin基因中的單核苷酸變異位點數(shù)（S）比基礎(chǔ)群體要少，而核苷酸多態(tài)性（Pi）和平均核苷酸差異數(shù)（K）要略高于基礎(chǔ)群體，這是由于快長群體在選育的過程中近交幾率大，多態(tài)性較低的單核苷酸變異位點因基因型純化現(xiàn)象而消失，而多態(tài)性較高的單核苷酸變異位

9、點得以保留，從而導(dǎo)致其平均核苷酸差異數(shù)和核苷酸多態(tài)性高于基礎(chǔ)群體。
　　2.尼羅羅非魚GHSR基因中生長相關(guān)SNP位點的篩選
　　從兩個尼羅羅非魚群體（快長群體和基礎(chǔ)群體）的GHSR基因中共篩選到5個有效SNP位點S1(A-409G)、S2(G-424T)、S3(T-553A)、S4(T-1114A)和S5(A-1168C)，均分布于該基因5′側(cè)翼區(qū)。SNP位點的基因型與兩個尼羅羅非魚群體子代生長性狀之間的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果顯示

10、：S4位點與平均核苷酸差異數(shù)（K）等遺傳參數(shù)的值都比快長群體中相應(yīng)值要高，說明尼羅羅非魚快長群體在選育的過程中導(dǎo)致該基因的遺傳多樣性降低。5個SNPs位點組成了7種雙倍型(D1-D7)，其中D3和D5雙倍型個體的體重、體長、體高、頭長、尾柄長、尾柄高等生長指標顯著高于D4和D7雙倍型個體(P<0.05)，而D1（體寬除外）、D2（體寬和尾柄長除外）和D6（體高除外）雙倍型個體與其它雙倍型個體之間在生長指標上均無顯著差異(P>0.05)。

11、尼羅羅非魚快長群體子代和基礎(chǔ)群體子代中的優(yōu)勢雙倍型分別為D3雙倍型（46.25%）和D4雙倍型（35.44%）。以上結(jié)果表明，尼羅羅非魚GHSR基因中S4位點處AA、AT基因型及雙倍型D3、D5與快長性狀密切相關(guān)，可作為尼羅羅非魚分子標記輔助選育的候選標記。
　　3.尼羅羅非魚ghrelin基因中生長相關(guān)SNP位點的篩選
　　從兩個尼羅羅非魚群體（快長群體和基礎(chǔ)群體）的ghrelin基因中共篩選到3個有效SNPs位點（S1(

12、A+134G)、S1(A+145G)和S1(A+155G)），均分布于該基因第1個內(nèi)含子中，3個SNPs位點的遺傳多樣性參數(shù)、基因型和基因頻率在同一群體中高度一致，SNP位點之間完全連鎖。兩個尼羅羅非魚群體子代中3個SNPs位點處的優(yōu)勢基因型相同，但快長群體子代中優(yōu)勢基因型的頻率要明顯大于基礎(chǔ)群體子代中相應(yīng)基因型的頻率。SNPs的基因型與兩個尼羅羅非魚群體子代生長性狀的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果表明，尼羅羅非魚個體的多項生長指標（體重、體長、體高、