水稻長護(hù)穎突變體和條紋葉突變體的基因鑒定與qRT-PCR表達(dá)分析.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分 水稻長護(hù)穎突變體的基因克隆與表達(dá)分析
　　利用EMS對水稻（Oryza sativa L.）保持系品種宜香1B進(jìn)行誘變，篩選出三份長護(hù)穎突變體Oslg-1，Oslg-2和Oslg-3，通過表型分析、等位性鑒定、基因定位和生物信息學(xué)分析，以及qRT-PCR表達(dá)分析，獲得如下結(jié)果:
　　1.Oslg-1突變體小穗在幼穗發(fā)育早期與野生型無明顯差異，但在成熟期其護(hù)穎的遠(yuǎn)軸表皮細(xì)胞

2、凸起且粗糙，形成的結(jié)節(jié)軸向?qū)R排列，且毛狀物較多，形成垂直相間的橫縱溝，表皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)與外稃的極其相似。
　　2.利用F2分離群體對突變體OsLg-1進(jìn)行基因定位，遺傳分析表明，Oslg-1受一對隱性單基因控制，將OsLG基因定位于第7染色體短臂SSR標(biāo)記RM5344和RM20934之間，遺傳距離分別為1.11 cM和0.82 cM，物理距離為246.3 kb。
　　3.對該區(qū)域候選基因測序分析，發(fā)現(xiàn)LOC_Os07g0467

3、0在編碼區(qū)第182位堿基發(fā)生突變(T→A)，導(dǎo)致其編碼蛋白第61位氨基酸改變(Leu→His)。等位性分析表明，Oslg-2，Oslg-3與Oslg-1屬等位變異，進(jìn)而對突變體Oslg-2和Oslg-3的OsLG基因進(jìn)行測序，其突變分別發(fā)生在第316位(T→A)和119位(T→C)堿基，導(dǎo)致其編碼的蛋白第106位氨基酸(Trp→Arg)和第40位氨基酸(Leu→Pro)發(fā)生突變。
　　4.對該基因進(jìn)行序列比對和同源進(jìn)化分析，其與南

4、美大穎稻較為相近，支持護(hù)穎系小花退化假說，該基因突變導(dǎo)致護(hù)穎伸長。
　　5.對該類突變材料的候選基因和另一控制護(hù)穎性狀的PAP2基因進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR(qRT-PCR)分析，結(jié)果表明OsLG基因在水稻的葉片、穗、葉鞘和根中均有表達(dá)，且在穗部表達(dá)最高，而PAP2基因在除穗部以外的其它部位幾乎不表達(dá)，表明2個控制護(hù)穎性狀的基因均具有組織特異性，且PAP2基因的特異性更強(qiáng)。在長護(hù)穎突變體中，2個基因表達(dá)量均下調(diào)，表明其具有協(xié)同表達(dá)特

5、點(diǎn)。
　　第二部分 溫敏型突變體stripe1-2和stripe1-3中的核糖核苷酸還原酶小亞基負(fù)責(zé)葉綠素的生物合成
　　本論文還對另兩份水稻白條紋葉突變體stripe1-2(st1-2)和stripe1-3(st1-3)進(jìn)行了研究。st1-2和st1-3是利用甲基磺酸乙酯(ethylmethane sulphonate，EMS)對9311進(jìn)行誘變而來，并經(jīng)過連續(xù)多代自交，條紋葉突變性狀能夠穩(wěn)定遺傳。主要研究結(jié)果如下:

6、>　　1.st1-2和st1-3突變體在二葉期之前表型均正常，從二葉期開始均出現(xiàn)白色條紋狀，到分蘗盛期條紋狀明顯加深。此外，st1-2隨溫度升高其條紋葉片葉綠素含量會緩慢升高，但直至成熟仍然呈條紋狀;st1-3隨溫度升高葉綠素含量迅速增加，達(dá)到30℃后能夠恢復(fù)生長出正常的綠葉。在農(nóng)藝性狀方面，包括株高、穗長、穗粒數(shù)、有效分蘗數(shù)、結(jié)實(shí)率及千粒重，st1-2和st1-3較之野生型均顯著下降，且st1-2的千粒重和結(jié)實(shí)率極顯著低于st1-3。

7、
　　2.光合速率在整個生長階段，野生型比突變體高，具體順序排列如下:WT＞ st1-3＞st1-2。在不同的發(fā)育階段，野生型中葉綠素a(Chl a)含量顯著高于突變體，葉綠素b(Chlb)含量只在抽穗期略高于突變體，在其他階段無明顯差異。
　　3.野生型、st1-2和st1-3的葉片亞顯微結(jié)構(gòu)的觀察表明，在拔節(jié)期，野生型細(xì)胞中淀粉粒比突變體中的多，突變體的葉綠體中基粒和類囊體膜的層狀結(jié)構(gòu)折疊仍發(fā)育良好，與野生型相比沒有顯著

8、差異;在抽穗期，st1-3葉綠體與野生型相比差異不大，但是st1-2的基質(zhì)類囊體排列松散;在分蘗期和抽穗期，st1-2和st1-3中的嗜鋨顆粒均比野生型顯著增多。
　　4.利用SSR標(biāo)記將突變體st1-2基因定位在第6條染色體短臂的RM3438和RM3431之間，進(jìn)一步設(shè)計(jì)Indel標(biāo)記將該基因精細(xì)定位于InDel標(biāo)記Ch6-819-1和Ch6-825-1之間，物理間距約為64kb。在st1-2定位區(qū)間中有四個功能基因，發(fā)現(xiàn)RNA

9、小亞基基因（RNRS1: LOC_Os06g14620）僅包含一個外顯子，測序發(fā)現(xiàn)其在第511位堿基發(fā)生突變(G→T)，導(dǎo)致其編碼蛋白第171位氨基酸(Val→Phe)改變。突變體st1-3與st1-2等位，但突變位點(diǎn)與st1-2不同，其在第685位堿基發(fā)生突變(C→T)，致其第229位氨基酸改變(Leu→ Phe)。
　　5.蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測分析表明，RNRS1由15個α螺旋和loop組成。核糖核苷酸還原酶小亞基中的第171位的Va

10、l屬于保守位點(diǎn)，且該突變位于α螺旋區(qū)域以及鐵離子活性區(qū)，因此可能導(dǎo)致嚴(yán)重的表型變異。但是第229的Leu位點(diǎn)在釀酒酵母、老鼠、人等生物中均為脯氨酸，水稻中這個基因的序列與約氏瘧原蟲的位點(diǎn)一致。雖然這些序列存在一些差異，但是其二級結(jié)構(gòu)均一致。st1-3突變位于loop區(qū)，Yoo等報(bào)道的st1突變位于α螺旋區(qū)，但均屬非鐵離子結(jié)合區(qū)，或許是導(dǎo)致其對溫度敏感程度以及表型有別于st1-2的原因所在。
　　6.利用參與葉綠素生物合成和降解途徑

11、的重要基因在不同的生長階段做qRT-PCR。結(jié)果表明，RNRS1突變主要影響葉綠素合成途徑的膽色素原合酶，糞卟啉原氧化脫羧酶，葉綠素酸酯a氧化酶，原卟啉原氧化酶，葉綠素合酶及脫鎂葉綠酸a加氧酶。其他基因的表達(dá)變化無明顯差異。表明RNRS1能調(diào)控參與光合作用的部分基因。
　　7.st1-2和st1-3在不同生長階段用不同的溫度處理，分別在野生型和突變體中檢測發(fā)現(xiàn)，在L20(Light20℃，14h)/D16(Dark16℃，10h)