FoxO3a及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在糖尿病性心肌病發(fā)病機制中的作用.pdf

1、背景: 心血管疾病是糖尿病患者的主要死亡原因，在西方國家約70％的糖尿病患者死于糖尿病性心血管疾病。自1972年Rubler等首次提出糖尿病性心肌病(Diabetic Cardiomyopathy，DCM)概念以來，流行病學(xué)、病理學(xué)以及實驗研究的結(jié)果均提示糖尿病性心肌病變的存在。糖尿病性心肌病變與糖尿病特有的代謝異常有關(guān)。其臨床特征早期以心臟舒張功能不全、晚期以收縮功能不全為主，容易發(fā)生充血性心力衰竭。 近年來國內(nèi)外學(xué)者

2、對DCM進行了大量的基礎(chǔ)和臨床研究，取得了階段性的成果。但DCM的發(fā)病機制、早期診斷和治療，仍處在研究探索中。深入研究DCM的發(fā)病機制，阻斷DCM的發(fā)病途徑對DCM的防治具有重要意義。 DCM發(fā)生受多種因素影響。心肌細胞代謝紊亂、微血管病變和氧化應(yīng)激被認為是其發(fā)生和發(fā)展的可能機制。研究表明，DCM早期就可以出現(xiàn)心肌細胞的凋亡和壞死。高血糖時氧化應(yīng)激增加，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑改變，引起異?；虮磉_，激活細胞程序化死亡。心肌細胞凋亡的信號轉(zhuǎn)

3、導(dǎo)機制可能是：①通過死亡受體轉(zhuǎn)導(dǎo)通路介導(dǎo)心肌細胞凋亡；②絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路；③磷脂酰肌醇3-激酶/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。DCM病理表現(xiàn)為心肌肥厚和心肌纖維化等。心肌成纖維細胞增生和其合成分泌膠原量及種類的變化，即心肌間質(zhì)重構(gòu)。心肌細胞的凋亡和心肌纖維化在DCM的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。 FoxO(Forkhead box O transcription factors)蛋白家族是2000年才正式發(fā)布統(tǒng)一命名的蛋白

4、質(zhì)家族，共可以分為17個亞家族，其分別被命名為FoxA～Q，在這17個亞家族中，F(xiàn)oxO亞家族主要通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控信號傳導(dǎo)途徑在動物的生長發(fā)育、細胞分化、代謝、凋亡和免疫等方面起重要作用。依據(jù)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域之外氨基酸序列的相似性，脊椎動物的FoxO亞家族成員又可進一步分為FoxO1、FoxO3和FoxO4。FoxO被生長因子激活的PI3K通路激活，產(chǎn)生Akt依賴磷酸化作用，磷酸化的Fox0激活或抑制細胞凋亡或細胞分裂周期相關(guān)的基因如：Bi

5、m、P27kip1、FasL、Bcl26、TRA IL、FLIP、MnSOD、GADD45(Za)，進而促進或抑制凋亡。 研究表明，很有可能FoxO因子依賴于細胞類型而激活不同的基因，F(xiàn)oxO可能依賴于適當(dāng)?shù)妮o助因子而對細胞起不同的作用，或者引起凋亡，或者不引起凋亡，或僅在應(yīng)激條件下誘導(dǎo)凋亡，從而引起不同的效應(yīng)。不同的研究對FoxO所誘導(dǎo)的凋亡基因表達的結(jié)果是有差別的，F(xiàn)oxO影響凋亡的機制目前尚遠未清晰。 文獻提示Fo

6、xO轉(zhuǎn)錄因子對細胞及細胞外基質(zhì)的病理生理學(xué)變化有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用。國外已有學(xué)者證實FoxO3a轉(zhuǎn)錄因子在內(nèi)皮細胞中通過PI3K/Akt/FoxO3a途徑調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞凋亡。FoxO3a轉(zhuǎn)錄因子是否參與了心肌細胞的凋亡國內(nèi)外尚未見報道。 研究表明，糖尿病目前的治療，包括血糖的控制，可以延緩疾病的發(fā)展，但僅僅控制血糖并不能充分減少糖尿病患者的心血管事件的發(fā)生和進程。因此探討該疾病發(fā)生和發(fā)展的潛在機制，尋找糖尿病性心肌病防治的新靶點已成為減

7、少糖尿病性心肌病病死率方面的亟待解決的問題。他汀類(Stmins)藥物是細胞內(nèi)源性膽固醇合成的限速酶-羥甲基戊二酸單酰輔A(3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzymeA，HMG-CoA)還原酶的抑制劑，能有效抑制膽固醇的合成，臨床已普遍用于治療高脂血癥。近年來有研究報道他汀類藥物對內(nèi)皮細胞有抑制凋亡作用，但其作用機制尚不完全清楚。Carmen Urbich等證實阿托伐他汀和美伐他汀可通過抑制PI3K/Akt/

8、FoxO3a/Bim途徑調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞的凋亡。他汀類藥物是否可通過抑制PI3K/Akt/FoxO3a途徑調(diào)節(jié)心肌細胞的凋亡、進而防治糖尿病性心肌病，目前國內(nèi)外亦尚未見報道。 本研究在分析糖尿病性心肌病細胞信號導(dǎo)途徑的基礎(chǔ)上，綜合運用分子生物學(xué)、細胞生物學(xué)、組織病理學(xué)、超聲心動圖技術(shù)和計算機圖像分析等方法，首次提出并探討了PI3K/Akt/Fox03a信號傳導(dǎo)途徑在糖尿病性心肌病心肌細胞凋亡中的作用，進而應(yīng)用HMG-CoA還原酶的抑

9、制劑瑞舒伐他汀對糖尿病性心肌病模型動物進行了干預(yù)治療，旨在探索糖尿病性心肌病藥物防治的新靶點。 目的:(1) 建立Wistar大鼠DCM動物模型； (2) 觀察DCM動物模型及瑞舒伐他汀干預(yù)組心肌組織病理學(xué)、超微結(jié)構(gòu)和心臟形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化； (3) 檢測DCM動物模型及瑞舒伐他汀干預(yù)組心肌細胞的凋亡； (4) 運用RT-PCR、Western-Blot、免疫組化等技術(shù)在大鼠DCM模型中驗證PI3K/Akt/

10、Fox03a通路的存在，探討該通路與心肌細胞凋亡的關(guān)系； (5) 評價瑞舒伐他汀在防治DCM中的潛在作用。 方法: 1.DCM動物模型的構(gòu)建雄性Wistar大鼠(200～240g)46只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分為三組；正常對照組(n=10只)，DCM組(n=18只)，DCM+瑞舒伐他汀組(n=18只)。DCM組和DCM+瑞舒伐他汀組給予高糖、高熱量飲食，4周后一次性腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ，30mg/kg，溶

11、解于10mM冷檸檬酸鹽緩沖液中，PH值4.2)。正常對照組以標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料喂養(yǎng)，4周后腹腔注射同等劑量的檸檬酸鹽緩沖液。注射STZ 72小時后取尾靜脈血測血糖，糖尿病大鼠成模標(biāo)準(zhǔn)為：連續(xù)2次空腹血糖≥11.1mmol/L，未達成模標(biāo)準(zhǔn)者剔除。達成模標(biāo)準(zhǔn)者進入下一步實驗，此后DCM+瑞舒伐他汀組大鼠每天以瑞舒伐他汀20mg/kg灌胃，DCM組和正常對照組大鼠以等量生理鹽水灌胃，繼續(xù)飼養(yǎng)20周。 2.體重和血生化檢查實驗過程中，進行以

12、下檢測：(1)每隔1周稱量體重1次，每隔2周檢測空腹血糖1次。(2)分別于STZ注射前、STZ注射后1周、實驗?zāi)┏檠獪y定空腹血糖、空腹胰島素、甘油三酯、膽固醇。 3.超聲心動圖檢測分別于糖尿病建模前、實驗?zāi)┻M行常規(guī)超聲心動圖檢查，測定如下指標(biāo)：M型超聲心動圖測定左室收縮末期內(nèi)徑(LVIDs)、左室舒張末期內(nèi)徑(LVIDd)、射血分數(shù)(EF)、短軸縮短率(FS)；彩色多普勒超聲心動圖觀察瓣膜返流情況；脈沖波及連續(xù)波多普勒超聲心動圖

13、測定二尖瓣口E波最大速度、A波最大速度、E/A比值、E波減速時間(EDT)、等容舒張時間(IVRT)、主動脈血流最大速度(APV)。根據(jù)心動周期，計算校正的EDT'(EDT'=EDT/心動周期)及IVRT'(IVRT'=IVTR/心動周期)。 4.透射電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)的改變5.心肌組織病理學(xué)檢查處死實驗動物后，進行組織取材、固定、脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋、切片，常規(guī)HE染色和Masson三色染色，觀察心肌細胞形態(tài)及膠原分布并拍片。

14、 6.采用TUNEL法檢測心肌細胞凋亡染成棕色的細胞核即為凋亡陽性細胞。計數(shù)方法：在×400物鏡下計算陽性細胞數(shù)占細胞總數(shù)的比例，選擇細胞總數(shù)200以上的視野，每個標(biāo)本觀察5張切片，取其平均值，從中計算陽性細胞率，取其平均值即凋亡指數(shù)(apoptosis index，AI)。 7.實時定量RT-PCR法檢測從心肌組織提取總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(RT)得到cDNA，以管家基因β-actin作為參照，通過實時定量RT-PCR技術(shù)

15、分別檢測三組PI3K、Akt、FoxO3a各因子的mRNA的表達。 8.免疫組織化學(xué)法檢測取組織切片，免疫組織化學(xué)法分別檢測三組的PI3K、Akt、FoxO3a的蛋白表達。 9.免疫印跡檢測取心肌組織，提取總蛋白，經(jīng)過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離、轉(zhuǎn)膜、蛋自印記、DAB顯色等步驟，分別檢測三組的PI3K、Akt、FoxO3a的蛋白表達。 結(jié)果: 1.實驗動物基本情況實驗過程中，正常對

16、照組大鼠精神狀態(tài)良好，體重增加明顯，反應(yīng)敏捷，毛色白而光澤。DCM組和DCM+瑞舒伐他汀組大鼠出現(xiàn)多飲、多尿、多食和消瘦等癥狀，體重增加遲緩，精神萎靡，皮毛無光澤，視力下降等。 整個實驗過程中3只大鼠死亡，其中DCM組2只，DCM+瑞舒伐他汀組1只，死亡原因可能與糖尿病酮癥酸中毒、感染或其他相關(guān)并發(fā)癥有關(guān)。DCM+瑞舒伐他汀組有1只大鼠血糖未達成模標(biāo)準(zhǔn)，予以剔除。最終共42只完成實驗，其中正常對照組10只，DCM組16只，DCM

17、+瑞舒伐他汀組16只。 2.體重與生化指標(biāo)高糖高熱量飲食喂養(yǎng)4周后，與正常對照組相比，DCM組和DCM+瑞舒伐他汀組大鼠體重、空腹胰島素、甘油三酯和膽固醇水平較高(P＜0.05～0.01)，空腹血糖無明顯差異(P＞0.05)。 結(jié)論: 1.應(yīng)用高熱量飲食喂飼和小劑量STZ注射，成功建立了糖尿病性心肌病大鼠模型，為DCM發(fā)病機制的研究提供了可靠的平臺； 2.心肌細胞凋亡，間質(zhì)纖維化，是DCM的主要組織病理改變；