綿羊Rad51基因的克隆與真核表達(dá).pdf

1、Rad51基因可以介導(dǎo)同源重組修復(fù)，有助于維持基因組的穩(wěn)定性，抵御細(xì)胞毒性因子對(duì) DNA造成損害。本研究通過(guò)建立綿羊 Rad51基因表達(dá)載體，并在綿羊成纖維細(xì)胞中表達(dá) Rad51蛋白，對(duì)比致使同一基因 DNA雙鏈斷裂的不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到綿羊成纖維細(xì)胞中 Rad51基因的表達(dá)情況，探討 Rad51基因真核表達(dá)用于克隆和提高同源重組效率，為提高綿羊成纖維細(xì)胞陽(yáng)性單克隆數(shù)量奠定理論和試驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法：試驗(yàn)一：選擇18月齡薩福克母羊耳緣皮

2、膚組織，采用Ⅳ膠原酶和胰酶替代物（TrypLETM Select）兩種混合酶消化法對(duì)耳緣成纖維細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)、細(xì)胞傳代、凍存、復(fù)蘇，以期獲得高純度的綿羊成纖維細(xì)胞。試驗(yàn)二：設(shè)計(jì)綿羊Rad51基因 cDNA PCR引物并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄 PCR，產(chǎn)物插入到帶有 AflⅡ和 XhoⅠ酶切位點(diǎn)的 pcDNA3.1（+）構(gòu)建真核表達(dá)載體 pcDNA3.1-Rad51，并用 PCR、酶切、測(cè)序進(jìn)行鑒定。試驗(yàn)三：選擇100μL電轉(zhuǎn)杯、 CZ-167程序

3、將4μg Rad51表達(dá)載體、作用于 MSTN的 CRISPR/Cas9質(zhì)粒和 TALENs質(zhì)粒分別導(dǎo)入到2×106個(gè)綿羊成纖維細(xì)胞，同時(shí)以 pMAX空載體為對(duì)照檢測(cè)質(zhì)粒在細(xì)胞中表達(dá)情況。試驗(yàn)四：采用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（Quantitative Real-time PCR）和蛋白免疫雜交（Western Blot）對(duì)經(jīng)電轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的成纖維細(xì)胞 Rad51基因在 mRNA和蛋白水平的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，試驗(yàn)數(shù)據(jù)用 LSD統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行分析。

4、>　　結(jié)果：試驗(yàn)一結(jié)果顯示：通過(guò)兩步酶消化法結(jié)合差速貼壁法可以獲得高純度的綿羊成纖維細(xì)胞，該細(xì)胞貼壁后呈長(zhǎng)梭形，生長(zhǎng)狀況良好（2天可以長(zhǎng)滿60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿）。試驗(yàn)二結(jié)果顯示：設(shè)計(jì)的 PCR引物從綿羊基因組擴(kuò)增獲得 Rad51基因 cDNA片段，將綿羊 Rad51基因序列測(cè)序結(jié)果與 NCBI公布序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)從 ATG起始密碼子開(kāi)始，第90位堿基發(fā)生替代：A-G（NCBI是 G）。氨基酸分析顯示第90位堿基替代并未改變氨基酸，改變后的密

5、碼子與 NCBI公布的密碼子為同義密碼子，其余部分序列完全一致，成功構(gòu)建綿羊 Rad51真核表達(dá)載體。試驗(yàn)三結(jié)果顯示：成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染 pMAX質(zhì)粒72h發(fā)現(xiàn)大量綠色熒光蛋白，且細(xì)胞在6孔板中的匯合度能達(dá)到80％以上。試驗(yàn)四結(jié)果顯示：DNA雙鏈斷裂，Rad51基因在 mRNA水平表達(dá)量極顯著高于正常細(xì)胞，蛋白質(zhì)表達(dá)量于正常細(xì)胞相比差異極顯著；不同的 DNA斷裂方式，Rad51基因的表達(dá)量亦不盡相同。
　　結(jié)論：以 pcDNA3.1（