殼聚糖抑制番茄葉霉病菌的活性與誘導(dǎo)抗性及其機(jī)理研究.pdf

1、本文以番茄葉霉病菌為試驗(yàn)菌種，對殼聚糖的抑菌活性及其機(jī)制進(jìn)行了研究。揭示了殼聚糖抑制番茄葉霉病菌的作用階段，研究了不同因素對殼聚糖抑菌活性的影響，推測了不同分子量殼聚糖的抑菌機(jī)理；檢測了殼聚糖誘導(dǎo)番茄產(chǎn)生對番茄葉霉病的抗性，并對其機(jī)制進(jìn)行了研究，為殼聚糖作為生物農(nóng)藥的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。測定了殼聚糖對番茄生長發(fā)育及其產(chǎn)量和品質(zhì)的影響，為殼聚糖在番茄生產(chǎn)上的應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。 一、殼聚糖樣品的制備 用醋酸降解的方法制備了一

2、系列不同分子量(38 KDa-1540 KDa)的殼聚糖樣品，且這些樣品的脫乙酰度均為80％左右；采用醋酸酐乙酰化法制得一系列不同脫乙酰度(73％-95％)的殼聚糖樣品，其分子量均在1600 KDa左右；并用紅外分光光度計(jì)(FT/IR-430)進(jìn)行了紅外圖譜檢測。 二、殼聚糖體外抑菌及其機(jī)理 用含毒介質(zhì)法測定了分子量、脫乙酰度、溶劑、環(huán)境pH值及濃度對殼聚糖抑制番茄葉霉病菌活性的影響。結(jié)果表明，殼聚糖對番茄葉霉病菌的孢子

3、萌發(fā)和菌絲體生長均具有明顯抑制作用，對產(chǎn)孢量影響不顯著。在研究范圍內(nèi)，隨濃度的增加和環(huán)境pH值降低，抑菌活性增強(qiáng)；使殼聚糖具有較好抑菌效果的溶劑是乳酸和醋酸；脫乙酰度為86％、分子量為213 KDa-499 KDa的殼聚糖抑菌效果較好。室內(nèi)藥效試驗(yàn)證明：低濃度殼聚糖對番茄葉霉病菌的抑菌效果不及三唑酮、多菌靈等常用殺菌劑；但當(dāng)濃度達(dá)到2 mg/ml時(shí)，它們的藥效相當(dāng)。 用光鏡、電鏡和激光共聚焦顯微鏡對不同分子量殼聚糖的抑菌機(jī)制進(jìn)行

4、了研究。光鏡觀察結(jié)果表明，濃度為0.5 mg/ml，分子量為82 KDa(CTS3)和1320 KDa(CTS7)的殼聚糖使菌絲體出現(xiàn)腫脹、分支增多、體細(xì)胞變短等形態(tài)學(xué)變化。掃描電鏡觀察，0.5 mg/ml的CTS3處理的菌絲體，腫脹但表面光滑，可能是殼聚糖進(jìn)入了菌絲體內(nèi)部；而CTS7處理的菌絲體，腫脹并且表面粗糙，殼聚糖凝聚在菌絲體周圍，形成了一層高分子膜。用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)一步觀察證明： 濃度為0.5 mg/ml、分子量小

5、于499 KDa的殼聚糖能夠進(jìn)入番茄葉霉病菌體內(nèi)；而分子量為1320 KDa的殼聚糖被阻擋在了菌絲體外面，從而推測不同分子量殼聚糖具有不同的抑茵機(jī)制。測定了殼聚糖對番茄葉霉病菌的滲透勢和幾丁質(zhì)酶活的影響。結(jié)果表明，殼聚糖處理后，在90 min內(nèi)菌絲體的相對滲透勢增加最快，其幾丁質(zhì)酶活也有一定程度的提高，闡明了殼聚糖的抑菌機(jī)制與其增加菌絲體細(xì)胞膜的透性和幾丁質(zhì)酶活有關(guān)。 三、殼聚糖誘導(dǎo)番茄對番茄葉霉病的抗性及其機(jī)理 用不同

6、分子量和不同濃度的殼聚糖對番茄進(jìn)行抗性誘導(dǎo)后接種，可在一定程度上誘導(dǎo)番茄植株產(chǎn)生對番茄葉霉病的抗性。隨殼聚糖濃度及其分子量的增加，誘導(dǎo)效果均呈現(xiàn)先增后減的趨勢，5 mg/ml左右的濃度、分子量為213 KDa的殼聚糖誘導(dǎo)效果較好；葉面噴施的誘導(dǎo)效果優(yōu)于浸種。葉面噴施濃度為5 mg/ml，分子量為213 KDa(CTS5)的殼聚糖誘導(dǎo)后，其相對防效達(dá)53.77％；而同濃度的CTS5浸種處理，相對防效為29.96％。 殼聚糖浸種和葉

7、面噴施均能不同程度地誘導(dǎo)番茄葉片中過氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、幾丁質(zhì)酶和β-1，3-葡聚糖酶的活性增加，但不同分子量殼聚糖、在不同濃度下、采用不同的處理方式對各種酶的作用效果不同，不同酶的時(shí)序變化也存在差異。 ①，兩種不同分子量的殼聚糖浸種處理，隨其濃度的增加，POD、PPO及β-1，3-葡聚糖酶的變化規(guī)律基本一致，而PAL和幾丁質(zhì)酶的變化規(guī)律不同。對于POD，CTS3的誘導(dǎo)效果好于CT

8、S7，而對于PPO、PAL、幾丁質(zhì)酶和β-1，3-葡聚糖酶，CTS7好于CTS3；CTS7在濃度分別為0.313、0.625、0.313、5、20 mg/ml時(shí)，POD、PPO、PAL、β-1，3-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶達(dá)最大值；而CTS3在濃度為0.313 mg/ml時(shí)，POD、PPO、PAL和β-1，3-葡聚糖酶達(dá)最大值，1.25 mg/ml時(shí)，幾丁質(zhì)酶達(dá)最大值。 ②五種不同分子量的殼聚糖葉噴處理，CTS5對POD、PAL和β-

9、1，3-葡聚糖酶的誘導(dǎo)效果較好，而分子量為3 KDa的殼聚糖(CTSl)和CTS3分別對PPO和幾丁質(zhì)酶的誘導(dǎo)效果較好。CTS5在濃度為6 mg/ml時(shí)，POD和PAL達(dá)最大值；3 mg/ml時(shí)，β-1，3-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶達(dá)最大值；10 mg/ml，PPO達(dá)最大值。CTS5處理，POD、PPO、PAL、β-1，3-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶分別在第5、2、3、1、2 d達(dá)最大值。③對于CTS3和CTS7兩種殼聚糖，在5 mg/ml的濃度下，

10、浸種處理時(shí)，CTS7比CTS3的誘導(dǎo)效果好；而葉噴處理，除PAL外，對其余四種酶的誘導(dǎo)效果，CTS3好于CTS7。葉噴處理比浸種處理對五種酶的誘導(dǎo)效果更好。 CTS5噴施次數(shù)對不同酶的影響不同：噴施一次PAL、幾丁質(zhì)酶和β-1，3-葡聚糖酶的活性增幅最大；噴施兩次POD活性增幅最大：噴施三次PPO的活性增幅最大。 進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，噴施殼聚糖CTS5后，PPO及PAL屬于系統(tǒng)獲得性誘導(dǎo)，而POD、幾丁質(zhì)酶和β-1，3

11、-葡聚糖酶屬于局部獲得性誘導(dǎo)。 用聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)對不同處理的番茄葉片內(nèi)總蛋白、POD和PPO同工酶進(jìn)行了分析。電泳圖譜顯示，總蛋白主要表現(xiàn)在區(qū)帶數(shù)目和著色深淺的不同：在殼聚糖葉噴次數(shù)對總蛋白的影響試驗(yàn)中，葉噴一、二次的處理，分別關(guān)閉或加強(qiáng)了某些基因的表達(dá)；葉噴三次的處理，只是加強(qiáng)了某些基因的表達(dá)。在不同分子量殼聚糖對總蛋白的影響中，CTSl的處理少兩條帶，CTS3、CTS7、CTS8少一條帶，說明他們關(guān)閉了某些基

12、因的表達(dá)；CTS5與對照數(shù)目相當(dāng)，著色略深，說明CTS5只是加強(qiáng)了某些蛋白的表達(dá)。不同殼聚糖濃度對總蛋白的影響中，6mg/mlCTS5處理的譜帶著色最深，說明該濃度CTS5最能加強(qiáng)某些蛋白的表達(dá)。而POD和PPO同工酶譜帶主要是著色深淺的區(qū)別，其主帶強(qiáng)弱變化基本與相應(yīng)的酶活性一致，但沒有發(fā)現(xiàn)新酶帶的增加。 葉噴殼聚糖對番茄葉片活性氧影響的試驗(yàn)結(jié)果表明，葉面噴施殼聚糖4 h后，出現(xiàn)活性氧爆發(fā)的現(xiàn)象；16 h后，又出現(xiàn)抑制氧自由基產(chǎn)

13、生的現(xiàn)象，推測殼聚糖對番茄的誘導(dǎo)抗性與活性氧的變化有一定關(guān)系。 藥效試驗(yàn)結(jié)果顯示，殼聚糖與三唑酮混施，對番茄葉霉病的防治效果明顯優(yōu)于生產(chǎn)上通常使用的多菌靈和三唑酮。10 mg/ml殼聚糖與500倍三唑酮的防效相當(dāng)。 四、殼聚糖對番茄生長發(fā)育的影響 以番茄(合作908)為試材，研究了殼聚糖對番茄種子萌發(fā)、生長發(fā)育、產(chǎn)量及品質(zhì)等的影響。結(jié)果表明：一定濃度的殼聚糖能夠明顯促進(jìn)種子萌發(fā)、提高番茄幼苗質(zhì)量和促進(jìn)其生長發(fā)育，

14、具有一定的增產(chǎn)效果，并能夠不同程度的改善番茄果實(shí)中可溶性固形物、Vc含量、總蛋白含量和總酸度，改善果實(shí)營養(yǎng)品質(zhì)與風(fēng)味；并且，不同分子量殼聚糖的作用效果不同。①適宜濃度殼聚糖能促進(jìn)番茄種子萌發(fā)。大田發(fā)芽試驗(yàn)，大分子量的CTS7和小分子量的CTS3分別在1.25 mg/ml和2.5 mg/ml濃度下，發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)三項(xiàng)指標(biāo)均達(dá)最大值。而室內(nèi)發(fā)芽試驗(yàn)，CTS7和CTS3分別在0.625mg/ml和1.25 mg/ml的濃度下，三項(xiàng)

15、指標(biāo)達(dá)最大值；在室內(nèi)試驗(yàn)中，大分子量的CTS7效果最差，中間分子量CTS3和CTS5效果最好。大田發(fā)芽試驗(yàn)比室內(nèi)試驗(yàn)成苗率明顯高。②殼聚糖對番茄幼苗的株高和鮮重影響顯著，但對根長和根鮮重影響達(dá)不到顯著水平的差異。浸種處理，CTS7在0.625～2.5 mg/ml之間對番茄生長的促進(jìn)效果較為明顯，在2.5 mg/ml達(dá)到最大值；CTS3在1.25～5mg/ml之間對番茄生長的促進(jìn)效果較為明顯，在5 mg/ml達(dá)到最大值。葉噴處理，CTS7