核仁素反義寡核苷酸對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞MG-63抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本研究共分為三部分。
　　第一部分 核仁素反義寡核苷酸的合成及功能鑒定
　　目的:
　　合成核仁素隨機(jī)、正義和反義寡核苷酸序列，為研究核仁素反義寡核苷酸對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞MG-63增殖的抑制作用做準(zhǔn)備。
　　方法:
　　(1)采用全硫代修飾合成核仁素隨機(jī)、正義和反義寡核苷酸序列，利用陽(yáng)離子脂質(zhì)體將其包裹后轉(zhuǎn)染進(jìn)入體外培養(yǎng)的人骨肉瘤細(xì)胞MG-63中;
　　(2)通過(guò)熒光顯微鏡觀(guān)察寡核苷酸是否有效轉(zhuǎn)染進(jìn)入人骨

2、肉瘤細(xì)胞MG-63內(nèi);
　　(3)RT-PCR、Western Bloting檢測(cè)轉(zhuǎn)染核仁素反義寡核苷酸后人骨肉瘤細(xì)胞MG-63中核仁素mRNA及蛋白表達(dá)的變化。
　　結(jié)果:
　　(1)熒光顯微鏡下觀(guān)察，可見(jiàn)約65％的細(xì)胞染上綠色熒光;
　　(2) RT-PCR及Western Bloting檢測(cè)轉(zhuǎn)染核仁素反義寡核苷酸后人骨肉瘤細(xì)胞MG-63中核仁素mRNA及蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示:核仁素反義寡核苷酸抑制了人骨肉瘤細(xì)

3、胞MG-63中核仁素mRNA和蛋白的表達(dá)，可使其表達(dá)水平下調(diào)。
　　結(jié)論:
　　(1)成功構(gòu)建核仁素反義寡核苷酸;
　　(2)有效地將核仁素反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染進(jìn)入人骨肉瘤細(xì)胞MG-63中。
　　第二部分 核仁素反義寡核苷酸對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞MG-63增殖抑制及誘導(dǎo)凋亡的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的:
　　探討核仁素反義寡核苷酸在抑制人骨肉瘤細(xì)胞MG-63增殖以及體外下調(diào)核仁素、Bcl-2蛋白和mRNA的表達(dá)與誘導(dǎo)細(xì)胞

4、凋亡的作用。
　　方法:
　　(1)將人骨肉瘤細(xì)胞MG-63隨機(jī)分為四組:對(duì)照組、轉(zhuǎn)染隨機(jī)寡核苷酸組、轉(zhuǎn)染正義寡核苷酸組與轉(zhuǎn)染反義寡核苷酸組;
　　(2)采用陽(yáng)離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的寡核苷酸技術(shù)將核仁素隨機(jī)、正義和反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染進(jìn)入人骨肉瘤細(xì)胞MG-63中;
　　(3)用MTT法檢測(cè)各組MG-63細(xì)胞的增殖率，并用Western Bloting和RT-PCR檢測(cè)各組MG-63細(xì)胞中核仁素、Bcl-2蛋白和mRNA的表

5、達(dá)情況;
　　(4)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組MG-63細(xì)胞的凋亡率。
　　結(jié)果:
　　(1) MTT檢測(cè)各組MG-63細(xì)胞增殖率顯示:核仁素反義寡核苷酸著抑制了人骨肉瘤細(xì)胞MG-63的增殖，與對(duì)照組、轉(zhuǎn)染隨機(jī)寡核苷酸組、轉(zhuǎn)染正義寡核苷酸組相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);
　　(2) Western Bloting和RT-PCR檢測(cè)各組MG-63細(xì)胞中核仁素、Bcl-2蛋白和mRNA的表達(dá)情況，結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染

6、反義寡核苷酸組與對(duì)照組、轉(zhuǎn)染隨機(jī)寡核苷酸組、轉(zhuǎn)染正義寡核苷酸組相比較，核仁素、Bcl-2蛋白和mRNA的表達(dá)均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);轉(zhuǎn)染隨機(jī)寡核苷酸組、轉(zhuǎn)染正義寡核苷酸組與對(duì)照組相比較，核仁素、Bcl-2蛋白和mRNA的表達(dá)無(wú)明顯影響，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05);
　　(3)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡率，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染反義寡核苷酸組與對(duì)照組、轉(zhuǎn)染隨機(jī)寡核苷酸組、轉(zhuǎn)染正義寡核苷酸組相比較，細(xì)胞凋亡率增高，差異

7、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　(1)核仁素反義寡核苷酸能抑制人骨肉瘤細(xì)胞MG-63增殖;
　　(2)核仁素反義寡核苷酸能誘導(dǎo)人骨肉瘤細(xì)胞MG-63凋亡。
　　第三部分 核仁素反義寡核苷酸對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞裸鼠移植瘤的抑制作用
　　目的:
　　探討核仁素反義寡核苷酸在抑制人骨肉瘤細(xì)胞裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)以及在體內(nèi)下調(diào)核仁素、Bcl-2蛋白和mRNA的表達(dá)與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。
　　方法:

8、
　　(1)將人骨肉瘤細(xì)胞MG-63懸液的細(xì)胞濃度調(diào)整為1×108/ml，每只裸鼠右前腿背側(cè)皮下注射0.2ml細(xì)胞懸液（細(xì)胞數(shù)為2×107/只），建立人骨肉瘤細(xì)胞裸鼠移植瘤動(dòng)物模型;
　　(2)將構(gòu)建成功的動(dòng)物模型隨機(jī)分為4組:對(duì)照組、隨機(jī)寡核苷酸組、正義寡核苷酸組、反義寡核苷酸組;
　　(3)采用瘤旁注射的方式，隨機(jī)寡核苷酸組、正義寡核苷酸組、反義寡核苷酸組分別于瘤旁注射2 mg/kg體重的隨機(jī)、正義及反義寡核苷酸;

9、對(duì)照組瘤旁注射等量生理鹽水，每日1次，共15次，觀(guān)察裸鼠及移植瘤的生長(zhǎng)狀態(tài);
　　(4)每3天以游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤1次，HE染色觀(guān)察移植瘤組織學(xué)形態(tài)，免疫組化檢測(cè)各組荷瘤鼠移植瘤組織中核仁素及Bcl-2的表達(dá)情況，Western Bloting和RT-PCR檢測(cè)各組荷瘤鼠移植瘤組織中核仁素、Bcl-2蛋白和mRNA的表達(dá)變化情況，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組荷瘤鼠移植瘤組織細(xì)胞凋亡率。
　　結(jié)果:
　　(1)以人骨肉瘤細(xì)胞株MG-

10、63成功構(gòu)建人骨肉瘤細(xì)胞裸鼠移植瘤動(dòng)物模型;
　　(2)反義寡核苷酸組與對(duì)照組、隨機(jī)寡核苷酸組、正義寡核苷酸組相比較，反義寡核苷酸組移植瘤體積明顯小于對(duì)照組、隨機(jī)寡核苷酸組及正義寡核苷酸組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);
　　(3)免疫組化檢測(cè)各組荷瘤鼠移植瘤組織中核仁素及Bcl-2的表達(dá)情況，結(jié)果顯示核仁素反義寡核苷酸在裸鼠體內(nèi)能夠抑制移植瘤組織中核仁素、Bcl-2的表達(dá)，與對(duì)照組、隨機(jī)寡核苷酸組及正義寡核苷酸組相比較

11、，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，隨機(jī)寡核苷酸組、正義寡核苷酸組與對(duì)照組相比較，移植瘤組織中核仁素、Bcl-2的表達(dá)無(wú)明顯影響，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05);
　　(4)Western Bloting和RT-PCR檢測(cè)各組荷瘤鼠移植瘤組織中核仁素、Bcl-2蛋白和mRNA的表達(dá)變化情況，結(jié)果顯示核仁素反義寡核苷酸在裸鼠體內(nèi)能夠抑制移植瘤組織中核仁素、Bcl-2蛋白和mRNA的表達(dá)，與對(duì)照組、隨機(jī)寡核苷酸組及正義寡核苷酸組相比

12、較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，隨機(jī)寡核苷酸組、正義寡核苷酸組與對(duì)照組相比較，移植瘤組織中核仁素、Bcl-2蛋白和mRNA的表達(dá)無(wú)明顯影響，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05);
　　(5)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組荷瘤鼠移植瘤組織細(xì)胞凋亡率，結(jié)果顯示反義寡核苷酸組移植瘤組織細(xì)胞凋亡率明顯高于對(duì)照組、隨機(jī)寡核苷酸組及正義寡核苷酸組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　(1)核仁素反義寡核苷酸在體內(nèi)能夠抑制人骨