間斷高糖對(duì)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞分泌VEGF的影響.pdf

1、目的:隨著人們生活方式的改變及人類壽命的延長(zhǎng),糖尿病的發(fā)病率日益增高,來(lái)自《中國(guó)2型糖尿病防治指南》2010年版討論稿的數(shù)據(jù)顯示:目前我國(guó)糖尿病患者總體發(fā)病率已達(dá)9.7％,另有15％的人為糖尿病前期,糖尿病前期人數(shù)達(dá)1億4千8百萬(wàn)以上,高于歐美發(fā)達(dá)國(guó)家水平,中國(guó)目前有超過(guò)9240萬(wàn)的糖尿病患者,已成為全球糖尿病第一大國(guó)。未來(lái)幾十年內(nèi)糖尿病仍是我國(guó)面臨的一個(gè)嚴(yán)峻的公共衛(wèi)生疾病問(wèn)題。糖尿病作為一種慢性病,其并發(fā)癥主要分為急性并發(fā)癥和慢性并發(fā)

2、癥兩種,糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)作為糖尿病慢性并發(fā)癥之一,其危害更是不容忽視,可引起視力下降,嚴(yán)重者可導(dǎo)致不可逆性視力喪失。目前認(rèn)為糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生是視網(wǎng)膜組織缺氧及微循環(huán)受損的結(jié)果,其發(fā)展與血糖控制程度及糖尿病病程長(zhǎng)短密切相關(guān),病程越長(zhǎng),DR的發(fā)病率越高。目前糖尿病視網(wǎng)膜病變的藥物治療尚不成熟,激光光凝治療是普遍為患者接受的延緩其發(fā)展的治療方法,但其提高視力的作用很弱。為了尋求有效的防治糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)生發(fā)展的方法,弄清其發(fā)病

3、機(jī)制勢(shì)在必行。目前的研究認(rèn)為DR的發(fā)生與糖代謝機(jī)制紊亂、多元醇-肌醇代謝通路的異常、非酶性糖基化作用、蛋白激酶C激活、血管舒張性前列腺產(chǎn)物、血流動(dòng)力學(xué)的改變、超氧化物歧化酶活性下降以及視網(wǎng)膜內(nèi)生長(zhǎng)因子水平的改變等有關(guān),其中細(xì)胞因子的作用尤其是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的作用日益受到關(guān)注。VEGF作為一種細(xì)胞生長(zhǎng)因子,具有增加血管通透性的作用,被認(rèn)為是目前所知的最強(qiáng)的內(nèi)皮細(xì)胞選擇性促有絲分裂因子和血管生成因子。體內(nèi)多種細(xì)胞包括視網(wǎng)膜色素

4、上皮細(xì)胞均可分泌VEGF,在正常情況下,視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞可少量分泌VEGF,高糖條件下可促進(jìn)視網(wǎng)膜內(nèi)VEGF的分泌,已有研究證實(shí)VEGF與DR密切相關(guān)。李才銳等[1]探討了非肥胖糖尿病小鼠血清和視網(wǎng)膜VEGF的表達(dá)及二者之間的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)隨著糖尿病的發(fā)展,糖尿病視網(wǎng)膜病變程度加重,而且血清VEGF含量增高,病程越長(zhǎng),血清中VEGF的含量就越高,揭示了血清VEGF含量和糖尿病病程之間的顯著的相關(guān)性。這一研究結(jié)果與糖尿病病程達(dá)10年以上者,

5、糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生率達(dá)到50％的研究結(jié)果一致[2]。而且糖尿病患者體內(nèi)的血糖不是一成不變的,它會(huì)隨著一些因素的影響而發(fā)生改變。餐后高血糖的控制不佳以及胰島素或促泌劑的不合理應(yīng)用,均可造成糖尿病患者的血糖波動(dòng)[3]。隨著對(duì)高糖毒性研究的日益深入,關(guān)于波動(dòng)性高糖的研究日益成為熱點(diǎn)。本研究模擬了糖尿病患者體內(nèi)血糖的急性波動(dòng)狀態(tài),通過(guò)比較波動(dòng)性高糖與恒定性高糖對(duì)人視網(wǎng)膜色素上皮(hRPE)細(xì)胞分泌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的影響,從而探討

6、間斷高濃度葡萄糖較恒定性高濃度葡萄糖是否更能促進(jìn)糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生發(fā)展。
　　 方法:
　　 將體外培養(yǎng)的人視網(wǎng)膜色素上皮(hRPE)細(xì)胞分為四組,每組設(shè)有6個(gè)復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)分組如下:A正常對(duì)照組:葡萄糖濃度為5.55mmol/L的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng);B恒定高濃度葡萄糖組:葡萄糖濃度為25mmol/L的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng);C間斷高濃度葡萄糖組:葡萄糖濃度為5.55mmol/L與葡萄糖濃度為25mmol/L的兩種條件的DM

7、EM培養(yǎng)液交替培養(yǎng),其中低糖2小時(shí),高糖3小時(shí)交替培養(yǎng),以高糖過(guò)夜;D高滲對(duì)照組:甘露醇濃度為19.4.5mmol/L+葡萄糖濃度為5.55mmol/L的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。四組分別于24小時(shí),48小時(shí)和72小時(shí)觀察細(xì)胞形態(tài),并收集細(xì)胞上清液,-20℃保存待測(cè)。按照VEGF試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)所收集的上清液中VEGF的含量。
　　 結(jié)果:
　　 1：分組培養(yǎng)24h時(shí)
　　 倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)較前無(wú)明顯變化,

8、經(jīng)檢驗(yàn)各組上清液中的VEGF水平無(wú)顯著性差異(P＞0.05);
　　 2：分組培養(yǎng)48h時(shí)
　　 倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)較前變化不明顯,經(jīng)檢驗(yàn)各組上清液中的VEGF水平無(wú)顯著性差異(P＞0.05);
　　 3：分組培養(yǎng)72h時(shí)
　　 與正常對(duì)照組(葡萄糖濃度為5.55mmol/L)相比,高滲對(duì)照組(甘露醇濃度為19.45mmol/L+葡萄糖濃度為5.55mmol/L的DMEM培養(yǎng)液)細(xì)胞在倒置顯微鏡

9、下觀察仍以長(zhǎng)梭形或多邊形為主,兩組間VEGF水平亦無(wú)顯著性差異(P＞0.05);
　　 與正常對(duì)照組(葡萄糖濃度為5.55mmol/L)相比,恒定高濃度葡萄糖組(葡萄糖濃度為25mmol/L)細(xì)胞在倒置顯微鏡下觀察可見細(xì)胞胞體變薄,形態(tài)不規(guī)則的細(xì)胞增多,且經(jīng)檢驗(yàn)恒定性高濃度葡萄糖組VEGF水平明顯升高,兩組間VEGF水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001);
　　 與正常對(duì)照組(葡萄糖濃度為5.55mmol/L)相比,間

10、斷高濃度葡萄糖組(葡萄糖濃度為5.55mmol/L與葡萄糖濃度為25mmol/L交替)倒置顯微鏡下觀察亦可見細(xì)胞胞體變薄,形態(tài)不規(guī)則,且經(jīng)檢測(cè)間斷高濃度葡萄糖組VEGF水平明顯升高,兩組間VEGF水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001);
　　 與恒定高濃度葡萄糖組(葡萄糖濃度為25mmol/L)相比,間斷高濃度葡萄糖組(葡萄糖濃度為5.55mmol/L與葡萄糖濃度為25mmol/L交替)形態(tài)不規(guī)則細(xì)胞較多,且VEGF水平明顯升