改良SD大鼠腎小管上皮細胞的原代培養(yǎng).pdf

1、目的：建立一種良好的SD大鼠腎小管上皮細胞原代培養(yǎng)、傳代及鑒定方法。
　　 方法：選用四周齡SD大鼠的腎皮質(zhì)進行細胞培養(yǎng)。在無菌條件下取腎，去除腎盂及包膜，將腎皮質(zhì)剪碎至1mm大小，洗去血液及尿液，0.25％胰蛋白酶消化20min，未消化皮質(zhì)再次消化20min，經(jīng)100目篩網(wǎng)、200目篩網(wǎng)過濾，收集200目篩網(wǎng)上物，離心后去上清，加入DMEM/F12培養(yǎng)基重懸，經(jīng)Percoll密度梯度離心法純化腎小管，選擇含10％胎牛血清的DM

2、EM/F12培養(yǎng)基進行原代培養(yǎng)及傳代。利用分離純化的腎小管節(jié)段，培養(yǎng)于24孔板內(nèi)，從第三天開始，每天檢測3孔細胞數(shù)量，繪制細胞生長曲線圖；制作細胞爬片，采用免疫細胞化學(xué)法，細胞角蛋白18表達陽性鑒定腎小管上皮細胞。
　　 結(jié)果：接種后觀察，視野中分布大量腎小管節(jié)段，純度在98％以上。原代培養(yǎng)24～48小時見腎小管節(jié)段大部分貼壁，少部分始終漂浮于培養(yǎng)液中、不能貼壁。24小時后有少量上皮樣細胞從腎小管節(jié)段周邊爬出，48小時后有大量卵

3、圓形上皮樣細胞從腎小管節(jié)段爬出、圍繞腎小管節(jié)段呈島嶼狀向四周擴展。72小時首次更換培養(yǎng)基，細胞生長旺盛、數(shù)量幾乎較48小時倍增，覆蓋45％左右培養(yǎng)瓶底。原代培養(yǎng)96小時，細胞達75％融合；培養(yǎng)120小時，細胞達95％以上融合。細胞于3～7天呈指數(shù)樣生長，5天后細胞已基本能達到融合、鋪滿瓶底，細胞呈多邊鵝卵石樣，透明度及折光性強。傳代后0的細胞生長迅速，4～5天后可傳第2代，傳3代后細胞可能因缺乏特殊的生長因子及特定的細胞外基質(zhì)，生長漸漸

4、緩慢，不能進一步傳代。原代培養(yǎng)的細胞經(jīng)免疫細胞化學(xué)鑒定，結(jié)果顯示：RTECs染色組中98％以上的細胞CK18表達陽性，可見細胞大小均一、細胞核中空而胞漿染色，胞核周圍和胞漿內(nèi)可見不均勻散在分布、強度不一的棕褐色顆粒狀、點狀染色。陽性染色結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察證實培養(yǎng)細胞98％以上為腎小管上皮細胞。
　　 結(jié)論：采用機械分離、胰蛋白酶2次消化、2次篩網(wǎng)過濾、結(jié)合Percoll密度梯度離心法分離純化腎小管后進行改良原代培養(yǎng)。結(jié)合形態(tài)學(xué)及免疫