急性HBV感染模型中NK細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制研究.pdf

1、HBV屬于嗜肝DNA病毒科，是有包膜病毒并含有大約3.2kb的環(huán)狀雙鏈DNA基因組。HBV感染可導(dǎo)致有或無臨床表征的肝炎。雖然已經(jīng)研發(fā)出預(yù)防性的高效疫苗，但是全球仍有大約3.5億人是慢性HBV感染者并且有發(fā)展為晚期肝臟疾病以及肝癌的風(fēng)險(xiǎn)。HBV的有效清除依賴于患者的年齡和免疫狀態(tài)，免疫應(yīng)答低下導(dǎo)致持續(xù)性或者慢性HBV感染。因此，宿主的免疫應(yīng)答在HBV感染過程中具有重要的作用。
　　 一直以來，免疫學(xué)家們認(rèn)為適應(yīng)性免疫系統(tǒng)在HBV

2、的清除和致病方面具有重要的作用，相比之下，作為天然免疫系統(tǒng)重要成分的NK細(xì)胞在HBV感染中的作用卻不是很清楚。雖有文獻(xiàn)表明清除小鼠的NK細(xì)胞導(dǎo)致HBV耐受的現(xiàn)象，以及急性HBV患者清除HBV的感染伴隨著體內(nèi)NK細(xì)胞活化的現(xiàn)象，但是對(duì)于HBV感染后NK細(xì)胞如何發(fā)揮抗HBV感染功能則知之甚少。近來，有很多關(guān)于NK細(xì)胞對(duì)適應(yīng)性免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)的報(bào)道。但是HBV感染過程中NK細(xì)胞是否具有對(duì)適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)功能也不是很清楚。因而，NK細(xì)胞在HBV

3、感染過程中是否具有重要的作用，以及NK細(xì)胞是否參與對(duì)后續(xù)適應(yīng)性免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)，以及兩大免疫系統(tǒng)如何相互協(xié)調(diào)介導(dǎo)HBV的清除？這正是我們所關(guān)心的問題。
　　 因此，本論文的研究目的在于研究HBV清除的免疫學(xué)機(jī)制，探討HBV感染過程中是否需要NK細(xì)胞的參與，以及重點(diǎn)探索NK細(xì)胞是否介導(dǎo)對(duì)適應(yīng)性免疫細(xì)胞的活化，以期為臨床慢性HBV患者的治療以及疫苗的研制提供新的策略。
　　 在本論文中對(duì)小鼠尾靜脈高壓注射pAAV/HBV1.2

4、質(zhì)粒，建立了小鼠急性HBV感染模型。利用該模型我們深入探討了HBV清除的免疫學(xué)機(jī)制以及NK細(xì)胞如何誘導(dǎo)適應(yīng)性免疫系統(tǒng)啟動(dòng)而清HBV感染。根據(jù)CD8-/-小鼠血清HBV相關(guān)抗原的檢測(cè)以及體外阻斷CD8+T細(xì)胞后上清中細(xì)胞因子的分泌情況評(píng)估CD8+T細(xì)胞在HBV清除中的作用;采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)NK細(xì)胞的活化，以及利用NK細(xì)胞清除和轉(zhuǎn)輸實(shí)驗(yàn)證明NK細(xì)胞如何參與抗HBV感染;通過對(duì)缺陷小鼠的特定細(xì)胞清除及過繼轉(zhuǎn)輸實(shí)驗(yàn)檢測(cè)NK細(xì)胞對(duì)CD8+T細(xì)胞

5、的影響;清除CD4-/-小鼠的NK細(xì)胞研究其是否參與NK細(xì)胞所介導(dǎo)的抗病毒及促進(jìn)CD8+T細(xì)胞的活化;利用轉(zhuǎn)輸實(shí)驗(yàn)及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)NK細(xì)胞對(duì)CD4+T細(xì)胞的調(diào)節(jié);通過抗體阻斷實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明DCs亦受到NK細(xì)胞的調(diào)節(jié)。另外，通過肝內(nèi)注射及尾靜脈高壓注射Ad-EGFP實(shí)驗(yàn)，以及手術(shù)摘除實(shí)驗(yàn)、體內(nèi)外分析肝臟淋巴結(jié)細(xì)胞等實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證肝臟淋巴結(jié)與肝臟的關(guān)系。利用免疫放射法(IRMA)定量檢測(cè)小鼠血清中HBsAg，HBeAg，anti-HBs，HBVD

6、NA以及ALT水平，以及H-E染色和免疫組化分析來WT小鼠以及缺陷小鼠中病毒的清除特點(diǎn);CBA檢測(cè)培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子的變化;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)NK細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞以及DCs的表型變化以及胞內(nèi)細(xì)胞因子的表達(dá)情況。通過上述一系列的研究方法，我們?nèi)〉萌缦碌膶?shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　 1.CD8+T細(xì)胞參與無細(xì)胞病變性在HBV清除過程中具有重要的作用
　　 通過對(duì)C57BL/6小鼠高壓尾靜脈注射20μgpAAV/HBV質(zhì)粒

7、，檢測(cè)血清HBsAg，HBeAg，anti-HBs，HBVDNA以及ALT水平。結(jié)果表明HBV在感染小鼠體內(nèi)能夠?qū)崿F(xiàn)HBV的復(fù)制，且表達(dá)HBV相關(guān)抗原，WT小鼠可在HBV感染后3-4周內(nèi)清除病毒感染，但是不引起肝細(xì)胞損傷和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，即為無細(xì)胞病變性感染模型，類似于人類急性HBV感染。為了進(jìn)一步檢測(cè)HBV的清除是否有免疫系統(tǒng)的參與，我們檢測(cè)CD8-/-小鼠在該模型中的特點(diǎn)，提示CD8-/-小鼠血清HBsAg和HBeAg均明顯高于WT小

8、鼠。分離WT小鼠脾臟的淋巴細(xì)胞，體外用α-CD8抗體阻斷CD8+T細(xì)胞的作用，導(dǎo)致脾臟淋巴細(xì)胞IFN-γ及TNF-α分泌能力均明顯降低，上述結(jié)果表明提示CD8+T細(xì)胞對(duì)于急性HBV感染模型中HBV的清除具有重要的作用。
　　 2.NK細(xì)胞來源的IFN-γ促進(jìn)HBV的清除
　　 我們?cè)谠撃Ｐ椭邪l(fā)現(xiàn)HBV質(zhì)粒高壓注射后第3天，脾臟NK細(xì)胞明顯增加，且CD69表達(dá)亦明顯增加。NK細(xì)胞在HBV質(zhì)粒高壓注射后第5天和第7天IFN-

9、γ表達(dá)明顯增加。為進(jìn)一步研究NK細(xì)胞在HBV清除中的作用，我們清除WT小鼠體內(nèi)的NK細(xì)胞，肝組織病理染色結(jié)果表明NK細(xì)胞清除小鼠的肝組織HBcAg表達(dá)以及血清HBsAg及HBeAg表達(dá)明顯高于對(duì)照小鼠。同樣NK細(xì)胞缺陷小鼠Nfi13-/-小鼠在HBV質(zhì)粒高壓注射后亦不能清除HBV感染，而且分別轉(zhuǎn)輸WT小鼠的NK細(xì)胞和GKO小鼠的NK細(xì)胞至Nfi13-/-小鼠，則發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)輸WT小鼠的NK細(xì)胞其血清HBsAg低于轉(zhuǎn)輸GKO小鼠NK細(xì)胞組。另外

10、對(duì)NK細(xì)胞清除小鼠尾靜脈注射mIFN-γ可以明顯降低NK細(xì)胞清除所導(dǎo)致血清HBsAg的升高。因此，上述結(jié)果表明NK細(xì)胞來源的IFN-γ是參與HBV清除的主要功能。
　　 3.NK細(xì)胞來源的IFN-γ促進(jìn)抗HBVCD8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答
　　 上述結(jié)果提示HBV清除過程中既需要CD8+T細(xì)胞的參與，又依賴于NK細(xì)胞的作用。那么二者之間是否存在調(diào)節(jié)作用呢？我們清除WT小鼠體內(nèi)NK細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)CD8+T細(xì)胞數(shù)目明顯減低;肝臟和脾臟

11、CD8+T細(xì)胞CD44+CD62L（-）CD8+T表達(dá)以及分泌IFN-γ明顯減低;(-)且NK細(xì)胞清除小鼠的肝臟HBV-特異性CD8+T細(xì)胞的活化明顯減低。為了明確NK細(xì)胞分泌的IFN-γ促進(jìn)CD8+T細(xì)胞的免疫應(yīng)答，我們清除CD8-/-小鼠體內(nèi)NK細(xì)胞，轉(zhuǎn)輸CFSE標(biāo)記的CD8+T細(xì)胞，并同時(shí)向NK細(xì)胞清除CD8-/-小鼠體內(nèi)分別轉(zhuǎn)輸WT小鼠的NK細(xì)胞以及GKO(Ifn-/-)小鼠的NK細(xì)胞，我們發(fā)現(xiàn)CFSE-CD8+T細(xì)胞在清除NK

12、細(xì)胞的受體中的增殖以及分泌IFN-γ的能力與對(duì)照小鼠(不清除NK細(xì)胞組)相比均明顯下降。轉(zhuǎn)輸WT小鼠的NK細(xì)胞則能促進(jìn)CFSE-CD8+T細(xì)胞的增殖以及分泌IFN-γ。相比之下，轉(zhuǎn)輸GKO小鼠NK細(xì)胞其促進(jìn)CFSE-CD8+T細(xì)胞的增殖及分泌IFN-γ的能力相對(duì)較弱。另外，轉(zhuǎn)輸CFSE-CD8+T胞至GKO小鼠體內(nèi)，并對(duì)一些受體小鼠轉(zhuǎn)輸WT小鼠的NK細(xì)胞，結(jié)果表明轉(zhuǎn)輸WT小鼠的NK細(xì)胞的受體小鼠，其肝臟和脾臟中CFSE-CD8+T細(xì)胞的

13、增殖及分泌IFN-γ明顯增強(qiáng)。綜上所述，NK細(xì)胞分泌的IFN-γ促進(jìn)CD8+T細(xì)胞的免疫應(yīng)答。
　　 4.NK細(xì)胞促進(jìn)抗HBV-CD8+T細(xì)胞的再次免疫應(yīng)答
　　 接下來，分選HBV質(zhì)粒高壓注射后第5天的脾臟CD8+T細(xì)胞并標(biāo)記CFSE，分別轉(zhuǎn)輸至NK細(xì)胞清除小鼠及對(duì)照小鼠體內(nèi)，24小時(shí)后對(duì)受體小鼠高壓注射HBV質(zhì)粒。發(fā)現(xiàn)NK細(xì)胞參于脾臟抗HBVCD8+T細(xì)胞的再次免疫應(yīng)答。為了進(jìn)一步佐證此觀點(diǎn)，我們又分選了HBV質(zhì)粒高

14、壓注射后第14天的肝臟CD8+T細(xì)胞并標(biāo)記CFSE，分別轉(zhuǎn)輸至NK細(xì)胞清除小鼠及對(duì)照小鼠體內(nèi)。同樣發(fā)現(xiàn)NK細(xì)胞清除小鼠的肝臟和脾臟中CFSE-CD8+T細(xì)胞的增殖及分泌IFN-γ的能力明顯下降。因此，NK細(xì)胞參于來自于肝臟或脾臟的抗HBVCD8+T細(xì)胞的再次免疫應(yīng)答。
　　 5.CD4+T細(xì)胞在NK細(xì)胞抗HBV感染及抗HBVCD8+T細(xì)胞活化中的作用
　　 為了檢測(cè)CD4+T細(xì)胞是否在NK細(xì)胞控制HBV的感染及調(diào)節(jié)CD8

15、+T細(xì)胞的活化中發(fā)揮作用，我們檢測(cè)Rag1-/-和CD4-/-小鼠清除HBV的情況，結(jié)果表明Rag1-/-和CD4-/-小鼠體內(nèi)雖然存在NK細(xì)胞，但是其不能發(fā)揮抗HBV作用。進(jìn)一步清除Rag1-/-和CD4-/-小鼠中NK細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)血清HBsAg的亦無明顯變化。而WT小鼠中NK細(xì)胞可控制HBV的感染。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CD4-/-小鼠體內(nèi)NK細(xì)胞不能促進(jìn)CD8+T細(xì)胞分泌IFN-γ，因?yàn)閃T小鼠的NK細(xì)胞明顯促進(jìn)HBV特異性CD8+T細(xì)胞分

16、泌IFN-γ。清除CD4-/-小鼠體內(nèi)的NK細(xì)胞也不能明顯改變CD4-/-小鼠體內(nèi)CD8+T細(xì)胞分泌IFN-γ。因此我們認(rèn)為CD4-/-小鼠的NK細(xì)胞間接抗HBV作用，以及間接調(diào)節(jié)CD8+T細(xì)胞。且NK細(xì)胞的抗病毒作用依賴于CD4+T細(xì)胞的存在。上述結(jié)果表明，CD4+T細(xì)胞不僅介導(dǎo)NK細(xì)胞的抗HBV感染，也參與其對(duì)CD8+T細(xì)胞的調(diào)節(jié)。
　　 6.CD4+T細(xì)胞輔助產(chǎn)生抗HBVCD8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答
　　 上述結(jié)果表明C

17、D4+T細(xì)胞參與HBV的清除，我們進(jìn)一步檢測(cè)CD4-/-小鼠清除HBV的能力，結(jié)果表明CD4-/-小鼠血清HBsAg和HBeAg均明顯高于WT小鼠，而且HBV質(zhì)粒高壓注射后第8周也不能清除HBV感染。提示CD4+T細(xì)胞也參與HBV的清除過程。轉(zhuǎn)輸小鼠的CD8+T細(xì)胞至Rag1-/-小鼠并不能幫助該小鼠清除HBV感染，提示CD8+T細(xì)胞抗HBV感染需要CD4+T細(xì)胞的輔助。另外，體外阻斷小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞的作用，亦導(dǎo)致脾臟淋巴細(xì)胞分泌

18、IFN-γ下調(diào)。因此，CD8+T細(xì)胞發(fā)揮抗HBV感染功能需要CD4+T細(xì)胞輔助。
　　 7.NK細(xì)胞促進(jìn)CD4+T細(xì)胞免疫應(yīng)答
　　 既然CD4+T細(xì)胞輔助CD8+T細(xì)胞抗病毒免疫應(yīng)答，而且NK細(xì)胞也促進(jìn)CD8+T細(xì)胞的免疫應(yīng)答。CD4+T細(xì)胞與NK細(xì)胞之間可能存在調(diào)節(jié)關(guān)系。比較CD4-/-小鼠與WT小鼠中NK細(xì)胞的功能，結(jié)果表明CD4-/-小鼠中NK細(xì)胞的功能正常。進(jìn)一步檢測(cè)NK細(xì)胞是否調(diào)節(jié)CD4+T細(xì)胞的功能，轉(zhuǎn)輸C

19、FSE標(biāo)記的CD4+T細(xì)胞至CD4-/-小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)NK細(xì)胞清除導(dǎo)致CFSE-CD4+T細(xì)胞在受體小鼠的肝臟和脾臟的增殖及IFN-γ分泌明顯減低。且分離來自于NK細(xì)胞清除小鼠的肝臟CD4+T細(xì)胞，體外經(jīng)Core129肽段刺激，產(chǎn)生分泌IFN-γ的HBV-特異性-CD4+T細(xì)胞的能力亦明顯減低。以上結(jié)果表明NK細(xì)胞不受到CD4+T細(xì)胞的調(diào)節(jié)，且NK細(xì)胞促進(jìn)CD4+T細(xì)胞的抗HBV免疫應(yīng)答。
　　 8.NK細(xì)胞分泌的IFN-γ促進(jìn)

20、CD11b+DCs免疫應(yīng)答
　　 NK細(xì)胞清除小鼠脾臟CD11b+DCs明顯減低，且CD11b+DCs表面CD86和CD80的表達(dá)也明顯下降，且脾細(xì)胞IL-18，IL-15和IFN-α的mRNA表達(dá)水平明顯下調(diào)。尾靜脈注射IFN-γ以清除小鼠體內(nèi)的IFN-γ，發(fā)現(xiàn)該小鼠脾臟CD11b+DCs的表達(dá)亦明顯下降下降，且脾細(xì)胞IL-15和IFN-α的mRNA表達(dá)水平亦下調(diào)。因此，NK細(xì)胞分泌的IFN-γ亦促進(jìn)脾臟CD11b+DCs的活

21、化，其可能介導(dǎo)后續(xù)適應(yīng)性免疫應(yīng)答的活化。
　　 9.肝臟淋巴結(jié)對(duì)于HBV免疫應(yīng)答發(fā)生的影響
　　 另外，通過對(duì)小鼠肝內(nèi)注射以及高壓尾靜脈注射Ad-EGFP，發(fā)現(xiàn)肝臟門部右側(cè)的淋巴結(jié)可以引流肝臟EFGP+細(xì)胞，提示肝臟淋巴結(jié)引流肝臟的細(xì)胞。并且發(fā)現(xiàn)肝臟淋巴結(jié)能產(chǎn)生抗HBV特異性免疫應(yīng)答。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明手術(shù)摘除肝臟淋巴結(jié)導(dǎo)致大約30％的HBV耐受小鼠出現(xiàn)，而摘除脾臟卻不影響小鼠HBV感染情況。進(jìn)一步確證了HBV感染模型中肝臟

22、淋巴結(jié)發(fā)生抗HBV的免疫應(yīng)答。檢測(cè)HBV感染后肝臟淋巴結(jié)細(xì)胞表型，發(fā)現(xiàn)HBV感染后CD8+T細(xì)胞及DCs發(fā)生增殖。因此，肝臟淋巴結(jié)可以發(fā)生針對(duì)HBV特異性免疫應(yīng)答。
　　 綜上所述，我們對(duì)成年雄性小鼠高壓尾靜脈注射pAAV/HBV1.2質(zhì)粒，建立模擬人類急性HBV感染的小鼠HBV感染模型。通過研究我們?cè)敿?xì)闡述了HBV清除的免疫學(xué)機(jī)制，明確了NK細(xì)胞在HBV的清除中的重要作用，證明了NK細(xì)胞分泌的IFN-γ介導(dǎo)了后續(xù)適應(yīng)性免疫的活