齊口裂腹魚MCH、CRH和GnRH2基因的克隆、組織分布及攝食功能研究.pdf

1、為研究黑色素聚集激素(melanin-concentrating hormone，MCH)、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(corticotropin-releasing hormone，CRH)和促性腺激素釋放激素(gonadotropin releasing hormone，GnRH)基因在齊口裂腹魚攝食調(diào)控中發(fā)揮的作用，本試驗(yàn)首先利用RT-PCR和RACE技術(shù)首次克隆了齊口裂腹魚(Schizothorax prenanti)MCH、CR

2、H和GnRH2的cDNA全序列;隨后運(yùn)用熒光定量PCR技術(shù)對(duì)MCH、CRH和GnRH2在不同組織的分布進(jìn)行了檢測(cè);最后研究在不同攝食狀態(tài)下MCH、CRH和GnRH2 mRNA在下丘腦表達(dá)的影響變化。
　　研究結(jié)果表明:齊口裂腹魚MCH eDNA全長(zhǎng)序列為589bp，其中5'非編碼區(qū)(5'-UTR)66 bp，3'非編碼區(qū)(3'-UTR)148 bp，開放閱讀框(ORF)375 bp，編碼124個(gè)氨基酸包括N末端24個(gè)氨基酸的信號(hào)肽

3、、C末端17個(gè)氨基酸的成熟肽和13個(gè)氨基酸的神經(jīng)肽Mgrp，與金魚(Carassius auratus)的MCH的序列同源性最高，相似性可達(dá)到90.3％;齊口裂腹魚CRH cDNA全長(zhǎng)序列的長(zhǎng)度為1046 bp，其中5'-UTR為127bp，3'-UTR為430bp，ORF為489 bp，編碼162個(gè)氨基酸包括24個(gè)氨基酸的信號(hào)肽、41個(gè)氨基酸的成熟肽和11個(gè)氨基酸的保守區(qū)域，與鯉科魚類特別是鯉魚(Cyprinus carpio) CR

4、H氨基酸序列一致性最高為96.3％;齊口裂腹魚GnRH2 cDNA全長(zhǎng)序列的長(zhǎng)度為693 bp，其中5'-UTR為160bp，3'-UTR為272bp，ORF為261 bp，編碼86個(gè)氨基酸包括24個(gè)氨基酸的信號(hào)肽、10個(gè)氨基酸的成熟肽和49個(gè)氨基酸的GnRH相關(guān)肽，其氨基酸序列與鯉魚，稀有鮈鯽（Gobiocyprisrarus）和斑馬魚(Danio rerio)的GnRH2具有很高的一致性分別為98.6％、95.9％、90.5％。

5、r>　　利用qPCR對(duì)齊口裂腹魚MCH、CRH和GnRH2 mRNA在不同組織的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示:MCH、CRH和GnRH2 mRNA在腦部的表達(dá)量最高。MCH mRNA主要在大腦和垂體分布，而在其他外周組織幾乎沒有表達(dá)。進(jìn)一步對(duì)腦部區(qū)域檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，MCH mRNA在下丘腦的表達(dá)最高，而在其他腦區(qū)域的表達(dá)都很低。CRHmRNA在外周組織中廣泛表達(dá)，進(jìn)一步研究CRH在腦部不同區(qū)域的表達(dá)的發(fā)現(xiàn)，除了小腦中幾乎沒有檢測(cè)到CRH mRNA表

6、達(dá)外，在其他區(qū)域均有表達(dá)且下丘腦的表達(dá)量最高。GnRH2 mRNA在所檢測(cè)的組織中都有表達(dá)，進(jìn)一步研究GnRH2在腦部不同區(qū)域的表達(dá)的發(fā)現(xiàn)，GnRH2 mRNA在腦部的不同區(qū)域都有表達(dá)，表達(dá)最高的是在下丘腦。
　　在餐前餐后的試驗(yàn)中設(shè)置7個(gè)處理組，且每個(gè)處理組放養(yǎng)15尾魚（體重為39.42±3.61g），將11:00作為0時(shí)每天進(jìn)行喂食。喂養(yǎng)兩周后，在喂食前3小時(shí)(8:00)，喂食前1小時(shí)(10:00)，喂食時(shí)(11:00)，喂食

7、后1小時(shí)(12:00)和喂食后3小時(shí)(14:00)取下丘腦進(jìn)行試驗(yàn)，其中有兩個(gè)組在0時(shí)不喂食作為禁食組。結(jié)果顯示:在餐后的1小時(shí)和3小時(shí)喂食組與對(duì)禁食組相比，下丘腦MCH mRNA表達(dá)量顯著下降(P＜0.05); CRH mRNA表達(dá)量沒有顯著差異(P＞0.05);GnRH2 mRNA表達(dá)量在餐后1小時(shí)和3小時(shí)都顯著增加(P＜0.05)。
　　長(zhǎng)期禁食試驗(yàn)中設(shè)置喂食組和禁食組各3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)各20尾魚(體重為36.75±4.1

8、2g)，喂食組正常喂食，禁食組禁食7天，第9天按之前喂食方法進(jìn)行復(fù)投喂直到14天。結(jié)果顯示:在第1，3，5和7天時(shí)，禁食組與對(duì)照組相比，下丘腦MCH mRNA的表達(dá)量顯著增加(P＜0.05)，而第9天復(fù)投喂組的MCH mRNA水平顯著下降，到第14天時(shí)與喂食組相比沒有顯著差異（P＞0.05）;在禁食的第7天，禁食組與對(duì)照組相比下丘腦CRH mRNA內(nèi)的表達(dá)量顯著降低（P＜0.05），復(fù)投喂組的CRH mRNA水平與喂食組相比有顯著增加（

9、P＜0.05），到第14天時(shí)，復(fù)投喂組CRH mRNA表達(dá)水平與喂食組一致;在禁食1，3，5和7天，禁食組與對(duì)照組相比下丘腦GnRH2 mRNA內(nèi)的表達(dá)量顯著降低（P＜0.05），第9天復(fù)投喂后，復(fù)投喂組的GnRH2 mRNA水平顯著升高，到第14天與喂食組相比無顯著差異（P＞0.05）。
　　結(jié)論:1、在齊口裂腹魚上首次克隆出了MCH、CRH和GnRH2基因的全長(zhǎng)序列;2、MCH、CRH和GnRH2在大腦中表達(dá)量最高;3、不同的