耐熱纖維素酶產(chǎn)生菌的篩選、鑒定及纖維素酶基因的克隆與表達(dá).pdf

1、當(dāng)前，粗纖維資源浪費(fèi)嚴(yán)重，污染問(wèn)題突出。我國(guó)畜牧生產(chǎn)中粗飼料利用率一直處于較低水平，而提高粗飼料利用率的有效途徑之一就是尋找可有效分解植物纖維素的纖維素分解菌，并以此得到足量的纖維素分解酶，用于畜牧業(yè)生產(chǎn)中。因此，本研究在來(lái)自陜西楊凌的取暖用地?zé)崴畼又袛M篩選一種耐熱性好、可分解纖維素的菌株，并通過(guò)基因工程技術(shù)改造其纖維素酶的調(diào)控基因，同時(shí)，通過(guò)優(yōu)化其培養(yǎng)條件旨在使纖維素酶的產(chǎn)量大幅度提高。本研究的主要結(jié)果為： 1．采用剛果紅染色

2、法從供試水樣中篩選到1株能夠分解纖維素的菌株。通過(guò)對(duì)其反復(fù)篩選得到了相應(yīng)的單菌落，菌落周?chē)忻黠@的水解圈。采用DNS法測(cè)定其菌液，發(fā)現(xiàn)有明顯的纖維素酶活力。經(jīng)革蘭氏染色觀察證明該細(xì)菌為芽孢桿菌屬革蘭氏陽(yáng)性菌。經(jīng)PCR擴(kuò)增其基因組DNA中的16SrDNAb保守序列片段，測(cè)序并進(jìn)行序列分析發(fā)現(xiàn)該細(xì)菌的16SrDNA保守序列與部分枯草桿菌的保守序列的同源性達(dá)到100％。結(jié)合形態(tài)學(xué)的觀察，將該細(xì)菌命名為B．subtilis DR。 2．

3、通過(guò)6個(gè)獨(dú)立的單因子篩選試驗(yàn)，首先確立了6種影響細(xì)菌生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的環(huán)境因素的最佳水平；進(jìn)一步通過(guò)這6中因子的組合試驗(yàn)篩選建立了該細(xì)菌生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的最佳條件，即該菌適宜在pH6.5、溫度37～41℃下生長(zhǎng)；產(chǎn)酶的適宜溫度為37～41℃，最適pH值為6～7，且發(fā)酵36h達(dá)到產(chǎn)酶高峰。應(yīng)用CMC-Na為碳源，蛋白胨為氮源的培養(yǎng)基，能夠使細(xì)菌良好生長(zhǎng)，并表現(xiàn)較強(qiáng)的產(chǎn)酶能力。 3．通過(guò)大量培養(yǎng)獲得了該菌纖維素分解酶的酶蛋白。研究表明該菌產(chǎn)生的

4、纖維素酶屬于耐熱性纖維素酶，只表現(xiàn)單一的內(nèi)切酶活性，最佳的酶促反應(yīng)溫度為50℃，最佳酶促反應(yīng)的酸堿環(huán)境為pH6.5的中性偏酸性環(huán)境，不耐強(qiáng)酸堿，具有比較強(qiáng)的耐高溫特性，如在溫度70℃下保溫處理30min，該酶仍保留70％以上的酶活力。 4．根據(jù)GenBank中已經(jīng)報(bào)道的枯草芽胞桿菌纖維素酶基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物，經(jīng)PCR從B．subtilis DR基因組DNA中擴(kuò)增得到一個(gè)約1.5Kb的基因片段，連接到T載體上進(jìn)行測(cè)寧，獲得到

5、該基因片段的DNA序列，進(jìn)一步的在線比對(duì)分析表明該基因的部分堿基序列與已報(bào)道的纖維素酶基因的序列同源性達(dá)97％以上。該基因的全序列在GenBank中未見(jiàn)報(bào)道。借助VecterⅦ軟件分析確定該基因全長(zhǎng)為1524bp，基因序列為一個(gè)完整的閱讀框，起始密碼為ATG，終止密碼TAG連續(xù)編碼508個(gè)氨基酸。 5．通過(guò)第二對(duì)特異性引物擴(kuò)增該纖維素酶基因，并在其5’端和3’端分別引入限制性酶切位點(diǎn)BamHI和NotI，將該基因序列克隆到表達(dá)載