高壓氧治療促新生大鼠缺氧缺血性腦損傷內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、遷移與分化及其機(jī)制研究.pdf

1、新生兒缺氧缺血性腦病(hypoxic-ischemic encephalopathy,HIE)是指圍產(chǎn)期窒息缺氧導(dǎo)致腦的缺氧缺血性損害,而出現(xiàn)的一系列中樞神經(jīng)異常的表現(xiàn)(新生兒學(xué)組,2005),是圍產(chǎn)期足月兒腦損傷的最常見原因(Triulzi,2006),?？梢鸩豢赡娴慕M織損傷,從而引起腦癱、癲癇、智力低下等嚴(yán)重后遺癥,給家庭社會(huì)帶來沉重的負(fù)擔(dān)。雖然目前HIE的發(fā)病機(jī)制研究取得了很大進(jìn)展,但臨床上仍以對(duì)癥、支持、綜合治療為主,缺少特異

2、性治療的方法,因此,尋找一種治療HIE行之有效的方法是一件十分有意義的事。干細(xì)胞治療與高壓氧(hyperbaric oxygen,HBO)治療是目前認(rèn)為比較有效的兩種治療方法。干細(xì)胞技術(shù)在最近幾年取得了重大突破,并已成為國(guó)內(nèi)外生物及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究中的熱點(diǎn)。干細(xì)胞治療又可分為內(nèi)源性NSCs(Neural stem cells,NSCs)原位激活和外源性干細(xì)胞移植兩大類,內(nèi)源性NSCs沒有外源性干細(xì)胞帶來的免疫排斥、倫理學(xué)道德問題,更適合于臨

3、床運(yùn)用。內(nèi)源性NSCs終生存在于側(cè)腦室室管膜下區(qū)(subventricular zone,SVZ)和海馬齒狀回(dentategyrus,DG)等腦內(nèi)某些特定的區(qū)域(Gage,2000),當(dāng)損傷發(fā)生時(shí)這些內(nèi)源性NSCs可被激活,對(duì)損傷的腦組織起到修復(fù)作用(Maslov,2004)。已有人報(bào)道,新生大鼠在缺氧缺血性腦損傷(hypoxic—ischemic brain damage,HIBD)后腦內(nèi)源性NSCs有增殖和分化現(xiàn)象(Hayash

4、i,2005)。但大腦自身的這種修復(fù)能力畢竟是有限的,如果能夠設(shè)法擴(kuò)大機(jī)體的這種自身修復(fù)能力將為干細(xì)胞治療帶來廣闊的前景(Felling,2006)。HBO作為目前一種比較有效的治療方法,用于治療新生兒疾病,特別是HIE已有多年歷史,但由于缺乏科學(xué)的理論依據(jù)和對(duì)毒副作用的誤解,在臨床應(yīng)用中有爭(zhēng)議。目前多數(shù)動(dòng)物研究認(rèn)為HBO對(duì)HIE治療有效,可減輕神經(jīng)元損傷,促進(jìn)遠(yuǎn)期功能的恢復(fù)(Badr,2001;Calvert,2002;Calvert

5、,2003;Veltkamp,2004);國(guó)內(nèi)大量臨床報(bào)道也表明HBO可以降低HIE的傷殘率和病死率(胡電,2004:蓋勇,2005)。我們最近的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)(余小河,2006)HBO治療HIBD新生大鼠時(shí),腦內(nèi)內(nèi)源性NSCs有增多的現(xiàn)象,提示HBO的治療作用可能與激活內(nèi)源性NSCs的增殖有關(guān),但其增殖的過程、分化為何種神經(jīng)細(xì)胞以及這些增殖的細(xì)胞能否遷移到腦損傷部位并真正起到代償作用等問題,目前尚不清楚。如能弄清楚這些問題將為HBO治療HI

6、BD提供可靠的理論依據(jù)。治療時(shí)間窗是影響HBO療效的重要因素,人們?cè)贖BO治療成體大腦中動(dòng)脈阻塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型的時(shí)間窗方面已做了大量的研究(Lou,2004;Badr,2001),認(rèn)為腦損傷后6小時(shí)內(nèi)HBO治療,可有效減輕梗死灶并能改善遠(yuǎn)期行為學(xué),但是由于新生大鼠處于發(fā)育階段,其研究較為復(fù)雜,在HBO治療新生大鼠HIBD的時(shí)間窗方面的研究甚少。根據(jù)成年大鼠MCAO模型的

7、研究結(jié)果,HBO必須在發(fā)病后的6小時(shí)內(nèi)開始治療才有效(Bard,2001;Yin,2002;Lou,2004;Zhang,2005),然而這6小時(shí)的時(shí)間窗太短,在臨床上很難在起病后的6小時(shí)內(nèi)即開始HBO治療,因此限制了HBO治療在新生兒HIE中的廣泛應(yīng)用。故探討HBO治療HIBD的時(shí)間窗具有重要意義。Wnt信號(hào)與神經(jīng)發(fā)生密切相關(guān),Wnt信號(hào)的激活可以促進(jìn)NSCs的增殖與分化(Inoue,2006;Hirabayashi,2005;Ino

8、ue,2004;Lie,2005),研究還發(fā)現(xiàn)Wnt途徑參與腦損傷后損傷組織的修復(fù)(Chong,2004),故推測(cè):HBO治療促進(jìn)內(nèi)源性NSCs的增殖是否與Wnt信號(hào)有關(guān)呢?解決這一問題將為HBO治療HIBD新生大鼠提供有力的理論依據(jù),并為更好地促進(jìn)NSCs增殖治療HIBD指明方向。
　　本實(shí)驗(yàn)分為以下三部分:
　　一、高壓氧治療促進(jìn)缺氧缺血性腦損傷新生大鼠內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、遷移與分化
　　目的:探討HBO治療對(duì)

9、HIBD新生大鼠腦內(nèi)源性NSCs增殖、遷移及分化的影響,為HBO治療的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　方法:7日齡Sprague-Dawley新生大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照(CON)組,缺氧缺血腦損傷組(HIBD)及高壓氧組(HBO治療:壓力為2個(gè)絕對(duì)大氣壓,穩(wěn)壓1 h,每日一次,連續(xù)7天)。采用經(jīng)典的Rice-Vannucci法制成HIBD模型,HBO組在HIBD后3 h內(nèi)進(jìn)行HBO治療。分別于HIBD后6 h,24 h,3 d,7 d,

10、14 d,采用BrdU/nestin免疫熒光雙標(biāo)法動(dòng)態(tài)檢測(cè)缺血側(cè)側(cè)腦室室管膜下區(qū)(subventricular zone,SVZ)、海馬齒狀回(dentate gyrus,DG)增殖的內(nèi)源性NSCs的動(dòng)態(tài)變化。Westem blotting法檢測(cè)缺血側(cè)大腦半球nestin蛋白的動(dòng)態(tài)變化。BrdU/DCX免疫熒光雙標(biāo)法檢測(cè)SVZ區(qū)增生的未成熟神經(jīng)元及其腦損傷區(qū)的遷移;BrdU/β-tubulin,BrdU/GFAP,BrdU/O4免疫熒光

11、雙標(biāo)法檢測(cè)大腦皮層新生的神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞,并計(jì)算各新生神經(jīng)細(xì)胞的分化比率。HIBD后28d,采用HE與Nissl染色法檢測(cè)腦組織的病理變化,并應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)胼胝體、紋狀體髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein,MBP)的表達(dá)。
　　結(jié)果:HBO組SVZ區(qū)與DG區(qū)BrdU+Nestin+細(xì)胞分別于HIBD后6 h與24 h顯著增加,7 d時(shí)達(dá)所觀察時(shí)間點(diǎn)的最高水平,并顯著多于各對(duì)照組(P<0.0

12、1),14 d時(shí),BrdU+Nestin+細(xì)胞數(shù)開始下降,仍多于各對(duì)照組(P<0.01);nestin蛋白的Western Blotting分析發(fā)現(xiàn)缺血側(cè)大腦半球nestin蛋白于HIBD后24 h開始增加,HIBD后7 d達(dá)最高水平,后下降;HIBD后7 d,HBO組SVZ區(qū)BrdU+ DCX+細(xì)胞表達(dá)顯著增加且高于CON組與HIBD組(P<0.05),14 d時(shí)SVZ區(qū)表達(dá)減少,同時(shí)在缺血側(cè)大腦皮層發(fā)現(xiàn)BrdU+ DCX+細(xì)胞,占皮

13、層BrdU+細(xì)胞的72.4±6.2％,顯著多于對(duì)照組(P<0.01;F=13.11);HIBD后28 d,HBO組缺血側(cè)大腦皮層神經(jīng)元分化比率與少突膠質(zhì)細(xì)胞分化比率均高于對(duì)照組(P<0.05),星形膠質(zhì)細(xì)胞的分化比率較低,HBO組缺血側(cè)大腦神經(jīng)元及髓鞘損傷明顯減輕。
　　結(jié)論:高壓氧可以促進(jìn)HIBD新生大鼠內(nèi)源性NSCs的增殖,增殖的NSCs遷移至損傷側(cè)的大腦皮層,并分化成為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞及少突膠質(zhì)細(xì)胞,修復(fù)腦損傷。

14、　　二、高壓氧治療新生大鼠HIBD的時(shí)間窗
　　目的:從HBO治療促進(jìn)內(nèi)源性NSCs增殖的角度探討HBO治療新生大鼠HIBD的最佳時(shí)間窗。
　　方法:采用經(jīng)典的Rice法制成HIBD模型。7日齡Sprague-Dawley新生大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照(CON)組,缺氧缺血腦損傷組(HIBD)及高壓氧組(HBO,其治療方法同前),HBO治療組HBO開始治療的時(shí)間分為5個(gè)亞組:1)HBO-3 h組、2)HBO-6h組、3)HBO-1

15、2 h組、4)HBO-24 h組、5)HBO-72 h組,每亞組20只。HIBD后10 d,BrdU/nestin免疫熒光雙標(biāo)法檢測(cè)各組大腦SVZ區(qū)內(nèi)源性NSCs的增殖情況,Western-blotting法檢測(cè)各組nestin蛋白的表達(dá)變化;至22日齡開始對(duì)各組動(dòng)物進(jìn)行T迷宮試驗(yàn)、放射性迷宮測(cè)試、足錯(cuò)誤行為學(xué)測(cè)試;行為學(xué)結(jié)束后,尼氏染色法檢測(cè)每馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞密度變化。
　　結(jié)果:BrdU/nestin免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果發(fā)現(xiàn):H

16、IBD后24 h內(nèi)給予HBO治療,SVZ區(qū)有大量的BrdU+nestin+細(xì)胞,即新增殖的內(nèi)源性NSCs,以3 h內(nèi)HBO治療組增殖最明顯(128±16個(gè)/mm2)。與此同時(shí),Western blotting法檢測(cè)缺血側(cè)(左側(cè))腦nestin蛋白的表達(dá),發(fā)現(xiàn)HIBD后24 h內(nèi)給予HBO治療,nestin蛋白表達(dá)顯著高于HIBD組;T迷宮試驗(yàn)、放射性迷宮測(cè)試、足錯(cuò)誤測(cè)試結(jié)果均表明HIBD后12 h內(nèi)給予HBO治療組均療效顯著;尼氏染色法

17、顯示HIBD后12 h內(nèi)HBO治療,海馬CA1區(qū)神經(jīng)元丟失較HIBD組顯著減少。
　　結(jié)論:HBO治療時(shí)間窗延長(zhǎng)至HIBD后12 h仍可促進(jìn)內(nèi)源性NSCs增殖,減輕神經(jīng)元損傷;延長(zhǎng)至72 h以后,HBO治療療效不顯著。
　　三、高壓氧治療通過Wnt信號(hào)途徑促進(jìn)HIBD新生大鼠腦內(nèi)NSCs的增殖
　　目的:檢測(cè)HBO治療后HIBD新生大鼠內(nèi)源性NSCs與Wnt信號(hào)途徑重要蛋白Wnt-3、β-catenin蛋白的動(dòng)態(tài)變化,

18、并進(jìn)行其相關(guān)性研究,從而探討HBO促進(jìn)內(nèi)源性NSCs增殖的機(jī)制。
　　方法:7日齡SD新生大鼠采用經(jīng)典的Rice法制成缺氧缺血腦損傷(HIBD)模型,結(jié)扎左側(cè)頸總動(dòng)脈,8%O2缺氧2 h,在HIBD后3 h內(nèi)給予HBO治療。免疫熒光雙重染色法動(dòng)態(tài)檢測(cè)HIBD后6h,24 h,3 d,7 d,14 d,新生大鼠缺血側(cè)室管膜下區(qū)(Subventriculaurzone,SVZ)nestin/Wnt-3,nestin/β-catenin

19、蛋白的表達(dá),激光共聚焦顯微鏡分析其熒光強(qiáng)度,并分別行Wnt-3與nestin,β-catenin與nestin熒光強(qiáng)度的相關(guān)性分析;western-blotting法檢測(cè)缺血側(cè)腦組織各時(shí)間點(diǎn)nestin,Wnt-3,β-catenin總蛋白及β-catenin核蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果發(fā)現(xiàn):各組SVZ區(qū)均可見nestin+Wnt-3+及nestin+β-catenin+細(xì)胞。HIBD后6 h,HBO治療組NSCs(

20、nestin+細(xì)胞)的細(xì)胞膜可見Wnt-3蛋白表達(dá)開始增加,HIBD后3d,5 d,7 d Wnt-3蛋白達(dá)較高水平,顯著高于對(duì)照組(P<0.05),HIBD后14 d,Wnt-3蛋白表達(dá)顯著減少(P<0.01);HIBD后24 h,HBO治療組NSCs(nestin+細(xì)胞)內(nèi)β-catenin蛋白表達(dá)開始增加,主要位于胞漿表達(dá),僅見少量胞核表達(dá),HIBD后3 d,胞質(zhì)內(nèi)β-catenin蛋白積聚、活化并開始向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移,HIBD后5

21、 d,7 d細(xì)胞核內(nèi)β-catenin蛋白維持較高水平并顯著高于對(duì)照組(P<0.01),HIBD后14 d,β-catenin蛋白表達(dá)顯著減少;HBO治療組nestin蛋白于HIBD后24 h表達(dá)開始增加,HIBD后7 d達(dá)較高水平,顯著高于對(duì)照組(P<0.05),后下降。HBO治療組nestin蛋白熒光強(qiáng)度分別與Wnt-3及β-catenin蛋白熒光強(qiáng)度呈直線相關(guān)。Western Blotting分析發(fā)現(xiàn)HBO治療組Wnt-3蛋白于H

22、IBD后3 d、5 d與7 d達(dá)較高水平,β-catenin蛋白于HIBD后5d、7 d達(dá)較高水平,nestin總蛋白分別于7 d達(dá)較高水平,β-catenin核蛋白于HIBD后5 d達(dá)較高水平,均顯著高于對(duì)照組(P<0.05);HIBD后14 d,各蛋白水平開始下降。
　　結(jié)論:高壓氧治療促進(jìn)內(nèi)源性NSCs增殖的機(jī)制與Wnt信號(hào)途徑中Wnt-3蛋白表達(dá)的增加及β-catenin蛋白的活化相關(guān)。
　　綜上所述,本研究結(jié)論如下

23、:
　　1.首次發(fā)現(xiàn)HBO治療可以促進(jìn)HIBD新生大鼠內(nèi)源性NSCs的增殖、遷移并分化成為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞及少突膠質(zhì)細(xì)胞,從而修復(fù)腦損傷。
　　2.從HBO治療促進(jìn)HIBD新生大鼠內(nèi)源性NSCs增殖的角度探討HBO治療HIBD的時(shí)間窗,并發(fā)現(xiàn)HBO治療的時(shí)間窗可以延長(zhǎng)至HIBD后12 h,大大括寬了治療時(shí)間窗,為HIBD的治療贏得了時(shí)機(jī)。
　　3.從Wnt信號(hào)途徑探討HBO促進(jìn)HIBD新生大鼠內(nèi)源性NSCs增殖的機(jī)