血液超氧化物歧化酶提純工藝改進及其抗氧化活性研究.pdf

1、超氧化物歧化酶英文簡稱SOD，是廣泛存在于生物體內(nèi)的一種重要酶，可催化超氧陰離子(O2-)與H+發(fā)生歧化反應(yīng)，生成H2O2和H2O并且可以使自由基的形成和清除處于動態(tài)平衡，從而抵御O2-的毒害作用，因而能清除機體內(nèi)生化代謝所產(chǎn)生的有害物質(zhì)超氧自由基，具有抗氧化、抗炎癥、抗輻射、抗腫瘤和抗衰老等功能。自1969年McCord首次從牛紅細胞中分離出SOD以來，人們相繼從牛、豬、羊、馬等動物紅細胞、肌肉、肝臟組織以及植物中分離和純化出SOD。

2、
　　 SOD根據(jù)其金屬輔助基的不同，可分為Mn-SOD、Fe-SOD、CuZn-SOD三種類型，Mn-SOD呈紫紅色，存在于真核細胞的線粒體和原核細胞中，相對分子量為40000，當(dāng)線粒體中的核酸DNA受到氧自由基的攻擊后，產(chǎn)生8-羥基去氧鳥嘌呤核苷酸，該產(chǎn)物是導(dǎo)致衰老的主要原因，而Mn-SOD具有阻止其損傷作用，F(xiàn)e-SOD呈黃褐色，存在于原核細胞和植物中，相對分子量38700。在動物血細胞中存在的為Cu Zn-SOD，呈淺蘭

3、色，相對分子量在32000左右，Cu Zn-SOD的三維結(jié)構(gòu)由2AX射線晶體結(jié)構(gòu)分析得到，每個酶分子由兩個亞基通過非共價健的疏水相互作用締合成二聚體，肽鏈內(nèi)部由半胱氨酸C55和C144的巰基(-SH)構(gòu)成的二硫橋?qū)喕喓掀鹬匾饔茫琑ichardso測定了其活性中心，指出由兩個亞基組成的SOD活性部位正好是以Cu2+為中心，試驗證明Cu2+是CuZn-SOD的活性中心，Zn2+與酶的穩(wěn)定性有關(guān)。
　　 在現(xiàn)有的SOD純化過程中

4、，粗分級工藝是不可避免的環(huán)節(jié)，其中必須使用大量的有機溶劑(如乙醇，氯仿等)或無機鹽(如硫酸銨，磷酸鹽等)，通過有機溶劑和無機鹽的分級沉淀去除大部分雜蛋白，獲得粗品SOD。然后才能使用后續(xù)工藝，如丙酮沉淀、超濾濃縮、透析、柱層析等，進行深入提純。首先，使用分級沉淀法提取目標(biāo)蛋白后，廢棄液中常常含有高濃度的有機溶劑或無機鹽，這些有毒/有害物質(zhì)的回收非常困難，而一旦排放又會對環(huán)保造成巨大壓力；其次，有機溶劑和無機鹽分級沉淀法操作周期長，提取液

5、經(jīng)常要在低溫下靜置過夜；另外，為了促使蛋白質(zhì)沉淀，有機溶劑和無機鹽的使用量通常都很大，抬高了產(chǎn)品的成本。因此，經(jīng)濟、高效、環(huán)保的蛋白質(zhì)純化技術(shù)一直是蛋白質(zhì)提純領(lǐng)域的瓶頸環(huán)節(jié)[9]。目前SOD的提取/生產(chǎn)工藝中，依然沿用傳統(tǒng)的分級沉淀技術(shù)，這使得SOD生化產(chǎn)品的成本和產(chǎn)量一直難以達到理想水平。
　　 本文就SOD從動物血液中提取工藝進行研究，首次利用低分子量聚丙烯酸鈉和氯化銅作為高效分散劑和激活劑來提純SOD，經(jīng)過溶血，熱變，丙酮

6、沉淀，超濾濃縮等獲得SOD粗品，并使SOD粗品酶活性達到傳統(tǒng)工藝提取分離的效果，該工藝大大簡化了傳統(tǒng)工藝，縮短了生產(chǎn)周期，另外層析是獲得SOD精品的重要一步，對SOD酶活力有很大提高，在采用沉淀分級后常采用層析方法純化SOD粗酶液，目前國內(nèi)外主要集中于凝膠過濾和離子交換層析方面，或者兩者的多步組合聯(lián)用，本文用改進工藝提取SOD后，分別利用SephadexG-75凝膠過濾層析和DEAE-sepharose-fast flow離子交換層析純