辣椒疫霉（Phytophthora capsici）致病遺傳變異、多聚半乳糖醛酸酶基因克隆及表達(dá)特性研究.pdf

1、辣椒疫病是一種世界性土傳病害，嚴(yán)重影響我國及世界各國的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。該病由辣椒疫霉菌(phytophthora capsici)所引起。辣椒疫霉菌是一種土傳卵菌，以卵孢子或厚垣孢子在土壤病殘?bào)w中越冬，可以存活數(shù)月甚至更長時(shí)間，在適宜條件下引起青椒莖腐、根腐和枯萎；寄主范圍廣，可以侵染辣椒、西葫蘆、黃瓜、番茄等9科20多種作物。 目前，對(duì)于辣椒疫病的防治主要采用化學(xué)防治，而培育抗病品種效果不穩(wěn)定，原因之一是辣椒疫霉

2、具有較強(qiáng)的變異能力。因此，尋找探索辣椒疫霉菌重要的致病因素成為科學(xué)家研究的對(duì)象。其中，多聚半乳糖醛酸酶(PG)是許多植物病原菌的致病因子，在植物發(fā)病過程中起重要作用。本研究以辣椒疫霉為研究對(duì)象，對(duì)來自我國不同地區(qū)的辣椒疫霉進(jìn)行了群體遺傳學(xué)研究，并分析了其致病力與地理位置、菌株起源的關(guān)系。篩選多聚半乳糖醛酸酶活性最高的辣椒疫霉菌株，并構(gòu)建了其基因組DNA文庫，應(yīng)用Pool PCR方法分離和克隆了7個(gè)pg基因。構(gòu)建了pcpg2基因的真核和原

3、核表達(dá)載體，通過誘導(dǎo)表達(dá)獲得重組蛋白，并制備了特異性抗體；應(yīng)用RT-PCR和Northern．Blotting方法分析了其在辣椒體內(nèi)的表達(dá)情況；純化真核表達(dá)蛋白接種辣椒葉片，觀察其發(fā)病癥狀。主要研究內(nèi)容如下： 2004-2005年，從我國山東、陜西、湖北、浙江、廣東、四川、云南等地采集辣椒疫病病株及病土分離鑒定辣椒疫霉菌株。通過利用12個(gè)隨機(jī)引物對(duì)來自我國7個(gè)不同地理區(qū)域的56個(gè)辣椒疫霉菌株進(jìn)行RAPD分析，探索了我國主要辣椒種

4、植區(qū)間的辣椒疫霉菌的遺傳分化關(guān)系。結(jié)果表明：我國主要辣椒種植區(qū)的辣椒疫霉菌具有較豐富的遺傳多樣性；并將供試56個(gè)菌株劃分為8個(gè)基因型(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ)，結(jié)合我國不同地理區(qū)域辣椒疫病發(fā)病情況，提出我國辣椒疫霉菌基因型的劃分除少數(shù)與地理區(qū)域有關(guān)外，其它絕大多數(shù)地區(qū)的辣椒疫霉菌基因型的劃分與地理來源無直接的相關(guān)性。 利用游動(dòng)孢子懸浮液浸根法測定辣椒疫霉菌株致病性，發(fā)現(xiàn)受試31菌株被劃分為非致病型、弱致病型和強(qiáng)致病型的三

5、種致病型。對(duì)其進(jìn)行RAPD分析發(fā)現(xiàn)，不同致病型的辣椒疫霉具有豐富的遺傳多樣性，并劃分為兩個(gè)大的基因型，但與菌株的致病型沒有顯著的關(guān)系。上述試驗(yàn)結(jié)果說明，來自不同地區(qū)的辣椒疫霉菌存在明顯的致病型分化，并有豐富的基因型，但兩者之間無明顯的對(duì)應(yīng)關(guān)系。利用RAPD技術(shù)對(duì)來自我國地區(qū)的致病性和非致病性辣椒疫霉菌株進(jìn)行群體遺傳多樣性分析，受試致病性和非致病性辣椒疫霉菌株分別聚為一組，但其中兩個(gè)非致病性菌株與致病性菌株聚為一組。ITS(ITS1-5.

6、8SrDNA-ITS2)序列分析結(jié)果表明，受試致病性和非致病性辣椒疫霉菌株分別聚為一個(gè)組。但非致病性辣椒疫霉菌的群體遺傳多樣性比致病性的要高，這說明致病性菌株可能是單系群起源。此外，致病性和非致病性辣椒疫霉菌株遺傳多樣性與其致病性沒有明顯的相關(guān)性。上述研究表明，我國辣椒疫霉菌存在豐富的遺傳多樣性及明顯的致病分化現(xiàn)象，但兩者之間無直接的相關(guān)性。 采用DNS(3,5-二硝基水楊酸)分光光度法測定辣椒疫霉菌的多聚半乳糖醛酸酶(PG)活

7、性，并構(gòu)建基因組文庫。利用Pool PCR法分離克隆Pg基因，對(duì)其結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，辣椒疫霉菌復(fù)壯后PG活性高于復(fù)壯前，且致病性菌株的PG活性高于非致病性菌株，構(gòu)建了PG活性最高最穩(wěn)定的菌株的基因組DNA文庫。從文庫中共分離克隆了7個(gè)pg基因，其GenBank注冊(cè)號(hào)分別是DQ365796、DQ415987、D0415988、EF558848、EF558847、EF558846及EF558845。對(duì)其序列和蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，

8、 7個(gè)pg基因具有很高的同源性，并具有不同數(shù)目的糖基化位點(diǎn)。所編碼的蛋白具多聚半乳糖醛酸酶的保守序列和蛋白活性位點(diǎn)(NNYCSGGHGISIGS)，其蛋白結(jié)構(gòu)也具明顯的相似性。本研究發(fā)現(xiàn)，辣椒疫霉的pg基因與卵菌的pg基因聚在一起，親緣關(guān)系最近，進(jìn)一步證明了卵菌在自然界中的分類地位。 根據(jù)已經(jīng)克隆的pcpg2基因的序列，設(shè)計(jì)特異性引物，PCR擴(kuò)增其成熟肽片斷。重組至酵母分泌型表達(dá)載體pPIC9K，構(gòu)建成重組表達(dá)載體pPIC9K-

9、pcpg2，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM109中，篩選得到陽性克隆。重組質(zhì)粒線性化后轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)過G418篩選和PCR．?dāng)U增轉(zhuǎn)化子基因組篩選，得到數(shù)株基因工程酵母菌。SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)，目的蛋白與預(yù)期蛋白的分子量相吻合。通過將酵母分泌的PG蛋白免疫家兔，制備特異性抗體。Western-blotting分析結(jié)果表明，表達(dá)的目的蛋白與制備的抗體在37KDa處特異性地結(jié)合?？傊琾cpg2基因在酵母中得到了表達(dá)，并制備了特

10、異性抗體。 根據(jù)pcpg2已知序列設(shè)計(jì)特異性引物，PCR擴(kuò)增其成熟肽序列。重組至原核表達(dá)載體pET-22b(+)，構(gòu)建成重組表達(dá)載體pET-pcpg2，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)，篩選得到陽性克隆用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。SDS．PAGE電泳顯示在37KDa處有一特異性蛋白帶出現(xiàn)，Western-bloaing檢測表明已經(jīng)成功表達(dá)了融合蛋白，更驗(yàn)證了已制備的抗體的特異性。培養(yǎng)辣椒疫霉菌，接種4-6葉期辣椒葉片。根據(jù)pcpg2

11、的序列設(shè)計(jì)特異性引物，RT-PCR檢測接種葉片內(nèi)．pcpg2的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，接種后pcpg2表達(dá)量隨著時(shí)間延長而加強(qiáng)，第7天pcpg2表達(dá)量最高。設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增片斷以制備探針，Northern-blotting結(jié)果表明，pcpg2基因在接種辣椒葉片內(nèi)得到表達(dá)，而未接種葉片則沒有表達(dá)。 純化真核表達(dá)蛋白PG2，提取辣椒葉片細(xì)胞壁，DNS法測定活性結(jié)果表明，純化的PG2對(duì)辣椒葉片細(xì)胞壁具有一定的活性。利用針刺法將純化的P