大蒜素基于誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞凋亡的抗肝纖維化作用及其機(jī)理研究.pdf

1、研究背景：肝纖維化是指各種致病因素引起的肝臟損害和炎癥，在修復(fù)過程中導(dǎo)致肝細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)異常增多和過度沉積的病理過程，肝纖維化既是一種代償修復(fù)反應(yīng)，又是肝損害的促進(jìn)因素，它遵循反復(fù)肝組織損傷機(jī)制，其持續(xù)發(fā)展可逐漸演進(jìn)至肝硬化甚至肝癌，預(yù)后極差。肝星狀細(xì)胞（HSC）的激活被公認(rèn)為是肝纖維化發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)?；罨蟮腍SC是肝臟ECM的主要生成細(xì)胞，并通過各種機(jī)制抑制ECM的降解，導(dǎo)致肝竇毛細(xì)血管化及小葉內(nèi)纖維化。肝星狀細(xì)胞激活的

2、機(jī)制尚未明確，參與HSC激活過程的因素主要有ECM成分和結(jié)構(gòu)的變化、生長因子、細(xì)胞因子、趨化因子、氧化性應(yīng)激產(chǎn)物等，涉及到復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。因此尋找抑制肝星狀細(xì)胞激活、促進(jìn)肝星狀細(xì)胞凋亡的途徑是防治肝纖維化的重要策略。如能采用某種方法對肝纖維化進(jìn)行逆轉(zhuǎn)，則對肝病患者的預(yù)后將有極大的改善，目前廣泛應(yīng)用于逆轉(zhuǎn)肝纖維化的有效途徑包括消除原發(fā)病，抑制膠原的產(chǎn)生和加速其降解，抑制肝星狀細(xì)胞（HSC)的激活和促進(jìn)其凋亡。其中抑制HSC的激活因

3、其從基因角度阻斷纖維化途徑的徹底性，已越來越受到國內(nèi)外研究機(jī)構(gòu)的重視。實(shí)驗(yàn)選用中藥單體大蒜素（Allitridum），化學(xué)名為二烯丙基三硫化物（DATS），來源于百合科多年生草本植物－大蒜，是大蒜中主要有效成分，已證實(shí)具有抗氧化、保護(hù)肝細(xì)胞、抗感染以及抗腫瘤等多方面的作用。但是其抗肝纖維化的作用國內(nèi)外少見報(bào)道，是近年來新發(fā)現(xiàn)的藥理作用之一，其抗肝纖維化的作用機(jī)制及其作用的具體階段亦尚不清楚，因此，本研究擬從體外實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)角度探討大蒜

4、素抗肝纖維化的作用及其分子發(fā)生機(jī)制。
　　第一部分體外研究:大蒜素（DATS）對肝星狀細(xì)胞（HSC）在細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞外基質(zhì)合成相關(guān)基因和蛋白表達(dá)等方面的影響。
　　目的:在體外環(huán)境下，觀察大蒜素（DATS）對肝星狀細(xì)胞（HSC）在細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞外基質(zhì)合成相關(guān)基因和蛋白表達(dá)等方面的影響。從細(xì)胞學(xué)、差異基因組學(xué)、蛋白組學(xué)角度揭示DATS對HSC凋亡和膠原合成功能的影響。
　　方法：將大鼠肝星狀細(xì)胞株 HSC-T

5、6于體積分?jǐn)?shù)為10％小牛血清及1×105IU/L的青霉素、100mg/L的鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，在37℃、5% CO2飽和蒸汽的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。并分為以下4組：溶劑對照組（DMSO）、DATS低劑量組（DATS6μg/ml）、DATS中劑量組（DATS12μg/ml）、DATS高劑量組（DATS24μg/ml）。
　　1.倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)的變化。
　　2.MTT法檢測各組細(xì)胞的增殖情況。
　　3.透射電

6、鏡觀察24μg/ml大蒜素作用12 h后的HSC-T6細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化。
　　4.流式細(xì)胞術(shù)檢測24μg/ml大蒜素作用6、12、24 h后對HSC-T6細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響。
　　5.qRT-PCR檢測大蒜素對HSC-T6細(xì)胞凋亡及細(xì)胞外基質(zhì)合成相關(guān)基因表達(dá)的影響。
　　6. Western-blot檢測大蒜素對HSC-T6細(xì)胞凋亡及細(xì)胞外基質(zhì)合成相關(guān)基因的蛋白表達(dá)影響。
　　7.運(yùn)用基因芯片技術(shù)和生物信

7、息學(xué)分析24 ug/ml大蒜素作用12 h后HSC-T6細(xì)胞的差異表達(dá)基因譜，qRT-PCR驗(yàn)證部分基因表達(dá)。
　　8.熒光差異顯示雙向凝膠電泳技術(shù)檢測24 ug/ml大蒜素作用12 h后HSC-T6細(xì)胞差異蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.光鏡觀察可見對照組HSC-T6細(xì)胞呈卵圓形或長梭形，貼壁生長，輪廓清晰，可見多角偽足，有的細(xì)胞成典型星芒狀。經(jīng)大蒜素作用12 h后，細(xì)胞密度變小，大部分細(xì)胞體積變小，細(xì)胞皺縮，偽足

8、消失，少數(shù)細(xì)胞胞漿濃縮致密，呈小圓形，出現(xiàn)凋亡的形態(tài)學(xué)改變，并隨著劑量的加大其變化更明顯。
　　2. MTT氮唑鹽比色實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示： DATS6μg/ml、12μg/ml、24μg/ml組均能明顯抑制 HSC-T6細(xì)胞的增殖，與對照組比較差異明顯，DATS24μg/ml組與DATS6μg/ml、12μg/ml組比較差異明顯，呈明顯的劑量依賴性關(guān)系。并且隨著DATS作用時(shí)間的延長，HSC-T6細(xì)胞的增殖抑制率逐漸上升，呈明顯的時(shí)間依

9、賴性關(guān)系。
　　3.正常的HSC核膜完整，染色質(zhì)均勻分布在核中，胞漿中各種細(xì)胞器清晰可見，DATS誘發(fā)凋亡的HSC體積變小,染色質(zhì)凝集、固縮,聚集于核膜下呈境界分明的塊狀或新月體形,有的可見核碎裂及凋亡小體形成。
　　4. DATS24μg/ml作用HSC-T6細(xì)胞6 h后凋亡率與對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，12、24 h后凋亡率均明顯高于對照組。細(xì)胞周期分析發(fā)現(xiàn)24 h后HSC-T6細(xì)胞出現(xiàn)明顯的G2/M期阻滯現(xiàn)象。

10、r>　　5.凋亡相關(guān)基因：與對照組比較，DATS12μg/ml組作用12h后，p53、Bax基因表達(dá)明顯升高；24h后Caspase3表達(dá)明顯升高。細(xì)胞外基質(zhì)合成相關(guān)基因：與對照組比較，DATS12μg/ml、24μg/ml組MMP-13基因表達(dá)明顯升高，TIMP-1、MAO基因表達(dá)明顯降低。
　　6.凋亡相關(guān)蛋白：與對照組比較，P53蛋白的表達(dá)水平逐漸升高。細(xì)胞外基質(zhì)合成相關(guān)基因蛋白：與對照組比較，MMP-13蛋白的表達(dá)水平逐漸

11、升高，COL I、α-SMA蛋白的表達(dá)水平逐漸降低。
　　7.獲得差異表達(dá)基因425條。其中上調(diào)表達(dá)基因180條，下調(diào)表達(dá)基因245條。分為10類，大部分與糖代謝，脂肪代謝，蛋白質(zhì)合成和電子傳遞過程有關(guān)。其中促進(jìn)細(xì)胞凋亡的相關(guān)基因 p53、Bax、caspase3均表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)合成的基因TIMP-1、 Egln1、Egln2、Egln3、Plod1均表達(dá)下調(diào)。 DAVID數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果表明，差異基因的表達(dá)與細(xì)胞通訊的黏

12、著斑、 Toll-like受體信號通路、JAK-STAT信號傳導(dǎo)通路、細(xì)胞色素P450的代謝通路等有關(guān)，進(jìn)一步IPA數(shù)據(jù)庫分析差異基因的表達(dá)與肝纖維化的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)其與Wnt/β-catenin信號通路、eNOS信號通路、PDGF信號通路以及活性氧介質(zhì)（ROI）的產(chǎn)生有關(guān)，其中前三條信號通路均與 HSC的活化有關(guān)，活性氧的產(chǎn)生與肝細(xì)胞的損傷有關(guān)。 qRT-PCR驗(yàn)證部分基因表達(dá)與基因芯片中的檢測結(jié)果一致。
　　8.獲得差異表達(dá)的蛋白

13、質(zhì)21個(gè)，其中表達(dá)上調(diào)的蛋白12個(gè)，表達(dá)下調(diào)的蛋白9個(gè)。按其功能可分為與核酸修復(fù)、細(xì)胞增殖與凋亡、基因轉(zhuǎn)錄與表達(dá)、代謝相關(guān)以及功能尚不清楚的蛋白質(zhì)。其中14個(gè)蛋白均與細(xì)胞凋亡直接或間接相關(guān)。包括膜聯(lián)蛋白A3（Annexin A3）、核基質(zhì)蛋白（NPM）、延伸因子1-delta（Elongation factor1-delta）、熱休克蛋白75（Grp75）、乙醛脫氫酶2（Aldehyde dehydrogenase2）等。
　　結(jié)

14、論:
　　1.大蒜素（DATS）能抑制HSC-T6細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡。
　　2.大蒜素（DATS）誘導(dǎo)HSC-T6細(xì)胞凋亡的機(jī)制與Bcl-2/Bax的比值下降以及 p53基因的表達(dá)升高有關(guān)。
　　3.大蒜素（DATS）通過上調(diào)HSC-T6細(xì)胞MMP-13基因的表達(dá)、下調(diào)TIMP-1、 MAO、α-SMA和COL I基因的表達(dá)，抑制細(xì)胞外基質(zhì)的合成，促進(jìn)其降解，從而阻止肝纖維化的進(jìn)一步發(fā)展。
　　4.基因組學(xué)的

15、研究結(jié)果顯示大蒜素誘導(dǎo)HSC-T6細(xì)胞凋亡的機(jī)制與p53、Bax、Caspase3基因表達(dá)上調(diào)有關(guān)，細(xì)胞外基質(zhì)的降解與TIMP-1基因的下調(diào)有關(guān)。差異基因表達(dá)所引起的信號通路的功能變化主要集中于以下5個(gè)方面：①誘導(dǎo)HSC的凋亡;②抑制HSC的活化;③抑制細(xì)胞外基質(zhì)的合成;④減輕活性氧對肝細(xì)胞損傷;⑤改善肝竇的微循環(huán)該藥物基因組差異圖譜為進(jìn)一步研究和分析大蒜素抗肝纖維化的作用靶點(diǎn)及作用機(jī)制研究提供了重要線索。
　　5.蛋白組學(xué)的研究

16、結(jié)果顯示大蒜素抗肝纖維化的作用機(jī)制與誘導(dǎo)HSC-T6細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，其中膜聯(lián)蛋白A3（Annexin A3）、熱休克蛋白75（Grp75）與細(xì)胞凋亡直接相關(guān)，為進(jìn)一步研究其分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
　　第二部分體內(nèi)研究:大蒜素對大鼠肝纖維化的保護(hù)效應(yīng)及對TGF-β/smad信號傳導(dǎo)通路的影響
　　目的：研究大蒜素（Allitridum）對四氯化碳（CCl4）所致大鼠肝纖維化的防治效果，并探討其對TGF-β/smad信號傳導(dǎo)通路

17、的影響。
　　方法：將43只wister大鼠隨機(jī)分為6組，雌雄各半?？瞻讓φ战M（n=4）：不做任何處理，自由飲食、飲水；溶劑對照組（n=7）：予植物油灌胃及腹腔注射；模型組（n=8）：予植物油灌胃，CCl4油溶液腹腔注射；大蒜素小劑量預(yù)防組（n=8）：予大蒜素11mg·kg-1·d-1，CCl4；大蒜素中劑量預(yù)防組（n=8）：予大蒜素22 mg·kg-1·d-1，CCl4；大蒜素中劑量治療組（n=8）：予大蒜素22 mg·kg-1

18、·d-1，CCl4。用植物油將CCl4配成40%的油溶液，按1ml· kg-1·次-1腹腔注射，每周2次，共8周；用植物油將大蒜素分別配成相應(yīng)濃度，按10ml· kg-1·次-1灌胃給藥，除大蒜素中劑量治療組在模型建立第5周給藥（共連續(xù)4周），余各組在建模開始時(shí)給藥（共連續(xù)8周）。所有大鼠在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間均喂標(biāo)準(zhǔn)食料，自由飲水。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后腹主動脈取血制備血清，采血后取肝臟左葉常規(guī)固定備用。以ELISA法檢測血清中ALT、AST、P INP

19、、P IIINP、CTGF、TGF-β、α-SMA、Smad2/3、p-Smad2/3、 Smad7的表達(dá)水平。肝組織作常規(guī)石蠟切片、HE染色、天狼猩紅染色，鏡檢觀察肝細(xì)胞變性、膠原纖維增生程度。
　　結(jié)果：
　　1.與空白對照組比較，溶劑對照組各項(xiàng)指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與空白對照組、溶劑對照組比較，模型組ALT、AST、P I NP、P IIINP、CTGF、TGF-β、α-SMA、Smad2/3、p-Smad2/3的表達(dá)

20、水平均明顯升高，Smad7的表達(dá)水平明顯降低。與模型組比較，大蒜素各治療組ALT、AST、P I NP、P IIINP、CTGF、TGF-β、α-SMA表達(dá)水平均明顯降低。其中中劑量預(yù)防組Smad2/3、p-Smad2/3的表達(dá)水平均明顯降低，Smad7的表達(dá)水平均明顯升高;中劑量治療組Smad2/3的表達(dá)水平明顯降低，p-Smad2/3的表達(dá)水平降低，Smad7的表達(dá)水平明顯升高。小劑量預(yù)防組p-Smad2/3的表達(dá)水平明顯降低。

21、r>　　2．肝組織HE染色和天狼猩紅染色結(jié)果顯示，空白對照組、溶劑對照組肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞排列整齊；模型組肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞，匯管區(qū)纖維組織明顯增生并伸入小葉將肝小葉分割，形成完全或不完全假小葉；大蒜素預(yù)防及治療組肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝組織匯管區(qū)及小葉內(nèi)散在點(diǎn)狀、星芒狀纖維組織增生，纖維間隔形成，但小葉結(jié)構(gòu)大部分保存，肝細(xì)胞變性與膠原纖維增生程度明顯減輕。
　　結(jié)論：
　　1.大蒜素具有抗肝纖維化作用:①大蒜素下調(diào)肌動蛋白α的

22、表達(dá)，抑制了HSC的活化。②大蒜素下調(diào)I型前膠原肽、III型前膠原肽的表達(dá)，抑制了細(xì)胞外基質(zhì)的合成。③大蒜素減輕肝組織膠原纖維的增生程度，延緩了纖維化的形成進(jìn)程。
　　2.大蒜素通過抑制TGF-β及TGF-β/smad信號通路的傳導(dǎo)，阻止HSC的激活、促進(jìn)其凋亡，從而發(fā)揮抗肝纖維化的作用。
　　3.大蒜素同時(shí)有保護(hù)肝細(xì)胞，改善肝功能的作用。
　　上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果均提示大蒜素在預(yù)防及治療肝纖維化的過程中具有積極的作用，大蒜素