鹽脅迫下甜瓜cDNA文庫構(gòu)建及NAC基因的功能分析.pdf

1、甜瓜（Cucumis melo L.）是世界上重要的園藝經(jīng)濟作物，廣泛栽培在干旱或半干旱地區(qū)。我國甜瓜栽培面積與產(chǎn)量位居世界前列。全世界可耕地面積的20％受到土壤次生鹽漬化的影響，土壤的鹽漬化使得作物生長發(fā)育滯緩，甚至植株死亡，產(chǎn)量品質(zhì)下降。
　　對于土壤鹽漬化給作物帶來的威脅，培育優(yōu)良的耐鹽品種是一個較好的策略，植物抗逆（耐鹽）成為當今世界研究的熱點。植物對于鹽脅迫的響應、抵抗是一個極其復雜的過程。植物耐鹽代謝有關通路依然不甚清

2、晰。本文以課題組前期篩選的兩個甜瓜品種（‘冰雪脆’為耐鹽;‘玉露’為鹽敏感材料），通過分子生物學和生理生化等相關方面的技術開展甜瓜鹽響應基因的篩選、家族分析、功能驗證等工作。主要研究結(jié)果如下。
　　以甜瓜幼苗冰雪脆、玉露的根為材料，通過抑制差減雜交的方法構(gòu)建了兩個cDNA文庫?！┐唷膸?39個、‘玉露’文庫604個EST測序，對其中的27個ESTs進行QRT-PCR鑒定與表達分析，24個ESTs受到鹽脅迫的誘導。ESTs經(jīng)過

3、MIPS數(shù)據(jù)庫功能分類，耐鹽品種冰雪脆在代謝、細胞命運、信號轉(zhuǎn)導、細胞修復比鹽敏感品種玉露所占的比例分別要大4％、1.46％、0.94％、0.4％。
　　對其中一類轉(zhuǎn)錄因子NAC進行深入分析。利用甜瓜基因組數(shù)據(jù)對甜瓜CmNAC基因家族進行鑒定、染色體分布、進化樹構(gòu)建。我們一共鑒定到甜瓜中有82個NAC，大多數(shù)甜瓜NAC蛋白具有高度保守的N端，并被分為5個保守的結(jié)構(gòu)域(A-E)，具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控domain的高度變異的C端，而5 CmN

4、ACs(CmNAC20、CmNAC22、CmNAC75、CmNAC28和CmNAC62)缺乏保守的A結(jié)構(gòu)域，其中CmNAC75、CmNA C28缺乏B、C和D結(jié)構(gòu)域。對甜瓜NAC蛋白的保守motif進行分析，相同亞家族的成員有著相似的motif組成，大多數(shù)保守motif分布在保守的N端，而在可變域的C端幾乎沒有保守motif的存在。鑒定出6個CmNAC(7.3％)轉(zhuǎn)錄因子具有跨膜結(jié)構(gòu)域。NAC基因在第11號染色體上分布最多（11個），第

5、五條染色體上僅有4個NAC基因，還有3個NAC基因無法定位到具體的染色體上。通過軟件分析，82個甜瓜NAC蛋白經(jīng)過多重序列比對、進化分析后分為7個亞家族，第Ⅰ和Ⅳ亞家族的基因數(shù)目最多(19個)，第Ⅶ亞家族數(shù)目最少（5個）。結(jié)合擬南芥NAC基因組數(shù)據(jù)，甜瓜NAC和擬南芥NAC基因家族共分8個亞家族，其中第Ⅳ亞家族和第Ⅵ亞家族分布最多（各有19個CmNAC），第Ⅶ亞家族僅有3個CmNAC基因。結(jié)合本實驗室轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)、前期文庫數(shù)據(jù)、擬南芥中與

6、鹽脅迫相關的NAC數(shù)據(jù)對甜瓜CmNAC的功能進行預測，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)、文庫數(shù)據(jù)、擬南芥與鹽相關的NAC主要集中在第Ⅳ亞家族，特別是第Ⅳ亞家族中的第二分支。對第二分支的9個CmNAC進行鹽脅迫下表達分析，顯示8個NAC受到鹽脅迫的誘導，一個CmNAC基因的表達受到鹽脅迫的抑制。對其中的CmNAC34和CmNAC14基因進行了轉(zhuǎn)酵母功能驗證，它們增加了酵母細胞對鹽分敏感程度，且CmNAC34可以抑制酵母的正常生長。
　　對表達量隨

7、著鹽脅迫時間增加而表達量增加的一個CmNAC14進行克隆全長、組織表達分析和逆境表達分析（干旱，熱，冷以及ABA）。表明該基因受到干旱、熱、冷以及ABA的誘導表達，在花中表達量最高，在根中表達量較少。通過煙草表皮亞細胞定位，得知該基因定位于細胞核上。對上述CmNAC14轉(zhuǎn)化擬南芥，通過對相關逆境基因表達和生理指標測定，結(jié)果顯示，與野生型擬南芥相比，過量表達CmNAC14轉(zhuǎn)基因植株在鹽脅迫下對鹽分敏感且根系生長受到抑制，逆境基因COR47