SOX9基因修飾骨髓間充質(zhì)干細胞修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨損傷.pdf

1、Sox9是軟骨發(fā)育形成過程中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，對軟骨的發(fā)育成熟等過程起著重要的調(diào)節(jié)作用。本研究設(shè)想sox9基因可能對出生后個體的間充質(zhì)干細胞也產(chǎn)生類似的作用，通過Sox9基因轉(zhuǎn)染，使骨髓間充質(zhì)干細胞高表達Sox9蛋白，直接啟動和激活Mscs的軟骨分化過程，然后利用sox9基因修飾的BMSCs修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨損傷，從而避免由于生長因子過度作用而產(chǎn)生的副作用，如果此設(shè)想能被驗證，將會為MSCs向軟骨方向定向分化找到新的方法，為軟骨損傷修復(fù)探索新途

2、徑。 本研究的目的在于：①建立一種骨髓間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)方法，從骨髓中快速分離純化出間充質(zhì)干細胞并進行體外培養(yǎng)擴增；②通過比較不同代次BMSCs的多向分化能力，明確體外傳代培養(yǎng)對BMSCs分化能力的影響，確定收集種子細胞的最佳時期；③擴增純化重組真核表達Sox9質(zhì)粒，用脂質(zhì)體做為載體轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細胞，觀察sox9基因在骨髓間充質(zhì)干細胞中的表達；④采用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)將sox9基因轉(zhuǎn)入兔骨髓間充質(zhì)干細胞中，觀察sox9基因高表

3、達對BMSCs軟骨分化的影響；⑤以藻酸鹽做為載體材料，負載Sox9基因修飾的骨髓間充質(zhì)干細胞移植于兔關(guān)節(jié)軟骨損傷區(qū)，觀察損傷修復(fù)的效果，旨在為組織工程學方法修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨損傷探索新途徑，為臨床治療關(guān)節(jié)軟骨損傷提供研究基礎(chǔ)。 本研究共分為五個部分: 第一部分、兔骨髓間充質(zhì)干細胞體外分離培養(yǎng)及生物學性狀觀察。 目的：建立一種骨髓間充質(zhì)干細胞快速分離純化的方法，優(yōu)化體外培養(yǎng)體系，體外擴增培養(yǎng)并初步鑒定骨髓間充質(zhì)干細胞，同

4、時觀察體外培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細胞的生物學性狀，旨在建立和優(yōu)化BMSCs的分離純化體系，為后續(xù)的組織工程軟骨損傷修復(fù)研究提供研究基礎(chǔ)和足夠的種子細胞。 方法：采用密度梯度離心和差速貼壁培養(yǎng)相結(jié)合的方法從兔骨髓組織中分離間充質(zhì)干細胞，進行體外傳代培養(yǎng)擴增，繪制細胞生長增殖曲線，測定細胞倍增時間，MTT法測定細胞代謝能力。流式細胞術(shù)測定細胞表面抗原，分析細胞周期，對分離細胞初步鑒定。 結(jié)果：密度梯度離心和差速貼壁篩選后所分離的

5、細胞大多為圓形的單核細胞，體外培養(yǎng)3次換液后，血細胞已基本去除。傳代培養(yǎng)后細胞生長較原代細胞明顯加快，傳代8代以內(nèi)細胞生長良好，增殖迅速，傳代10代后細胞呈現(xiàn)衰老征象。第10代細胞與第3、5、8代細胞相比，細胞倍增時間明顯延長。流式細胞術(shù)鑒定體外培養(yǎng)傳代三代后細胞已較為純化，表達間充質(zhì)細胞表面抗原CD44的細胞可達91. 7％，而表達造血細胞表面標志CD45的細胞僅為1.5％。 結(jié)論：利用密度梯度離心和差速貼壁培養(yǎng)法可迅速高效地

6、分離純化兔骨髓間充質(zhì)干細胞，體外培養(yǎng)8代以內(nèi)的兔骨髓間充質(zhì)干細胞均具有較強的增殖能力，可以作為軟骨組織工程研究的種子細胞。 第二部分、體外傳代培養(yǎng)對骨髓間充質(zhì)干細胞多向分化能力的影響。 目的：定向誘導骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨、成脂肪、成軟骨方向分化，以進一步鑒定所分離的細胞；同時觀察比較不同代次細胞的多向分化能力，研究體外培養(yǎng)傳代對MSCs多向分化能力的影響。 方法：選取第3代和第8代細胞，分別加入成骨誘導培養(yǎng)液，

7、成脂肪誘導培養(yǎng)液，成軟骨誘導培養(yǎng)液進行定向誘導培養(yǎng)，通過組織學觀察，生物化學測定，半定量RT—PCR和Western blot等對細胞的多向分化能力進行比較。 結(jié)果：經(jīng)過體外成骨誘導，成脂肪誘導，成軟骨誘導后，第3代和第8代骨髓間充質(zhì)干細胞均可以定向分化成成骨細胞、脂肪細胞和軟骨細胞。第3代細胞和第8代細胞的成骨分化能力和成脂肪分化能力無明顯差異。第8代細胞的成軟骨能力較第3代細胞明顯下降。 結(jié)論：本部分實驗顯示上一節(jié)實

8、驗中分離得到的CD44陽性／CD45陰性細胞可以向成骨、成脂肪和成軟骨方向分化，進一步證實了這些細胞是具有多向分化能力的MSCs。對第8代細胞和第3代BMSCs的多向分化能力的比較實驗顯示，雖然體外傳代培養(yǎng)對細胞的成骨和成脂肪分化能力無明顯影響，但是成軟骨分化的能力出現(xiàn)下降。進行軟骨組織工程及基因治療等研究時應(yīng)當采用體外培養(yǎng)時間較短的，分化能力較強的種子細胞，以保證移植治療的效果。 第三部分、重組真核表達Sox9質(zhì)粒的擴增鑒定及

9、轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細胞。 目的：擴增純化鑒定sox9質(zhì)粒。利用脂質(zhì)體做為載體，介導重組真核表達Sox9質(zhì)粒轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細胞，觀察Sox9基因在骨髓間充質(zhì)干細胞中的表達。 方法：將含有Sox9基因的真核重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌對質(zhì)粒進行擴增，采用堿裂解法和樹脂吸附法分離提純質(zhì)粒，通過限制性核酸內(nèi)切酶酶切和基因測序的方法對質(zhì)粒進行鑒定。脂質(zhì)體載體介導重組Sox9質(zhì)粒和EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染兔骨髓間充質(zhì)干細胞，利用RT—PCR和W

10、estern blot檢測目的基因產(chǎn)物的表達。同時利用流式細胞術(shù)和熒光顯微鏡測定基因轉(zhuǎn)染效率。 結(jié)果：DNA純度檢測結(jié)果顯示所提取的質(zhì)粒較為純化，OD260／OD280值在1.7～1.8之間。限制性內(nèi)切酶酶切和基因測序結(jié)果證實Sox9質(zhì)粒正確，未發(fā)生突變。RT—PCR和Western blot檢測結(jié)果顯示Sox9質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細胞開始表達目的分子。流式細胞檢測顯示MSCs的轉(zhuǎn)染效率為26.8％，倒置熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率為22％±3

11、.8％。 結(jié)論：利用脂質(zhì)體介導重組Sox9質(zhì)?？梢猿晒D(zhuǎn)染兔骨髓間充質(zhì)干細胞，外源性Sox9基因可以在BMSCs中表達，并產(chǎn)生其編碼的目的蛋白。 第四部分、Sox9基因轉(zhuǎn)染對BMSCs軟骨分化影響的實驗研究。 目的：觀察Sox9基因轉(zhuǎn)染對間充質(zhì)干細胞向軟骨方向分化的影響，為基因強化軟骨組織工程探索新途徑。 方法：利用脂質(zhì)體介導重組Sox9質(zhì)粒轉(zhuǎn)染兔骨髓間充質(zhì)干細胞，Geneticin篩選穩(wěn)定表達細胞。通過

12、細胞生長代謝和細胞周期分析觀察基因轉(zhuǎn)染對細胞的影響。通過RT—PCR，Western blot，免疫組織化學染色及GAG含量測定等檢測Sox9基因轉(zhuǎn)染對BMSCs成軟骨分化的影響。 結(jié)果：Sox9基因轉(zhuǎn)染組與對照EGFP基因轉(zhuǎn)染組細胞在細胞生長代謝和細胞周期分布上均無明顯差異。Sox9基因轉(zhuǎn)染后，BMSCs出現(xiàn)向軟骨方向的分化，細胞表達軟骨特異性分子Ⅱ型膠原和Aggrecan，GAG含量明顯增加。免疫組織化學顯示Sox9轉(zhuǎn)染組Ⅱ

13、型膠原染色陽性，兩對照組均為陰性。 結(jié)論：外源性Sox9基因轉(zhuǎn)染未對BMSCs的生長造成明顯影響。Sox9基因轉(zhuǎn)染后可以啟動BMSCs向軟骨細胞方向的分化。 第五部分、Sox9基因修飾BMSCs修復(fù)兔膝關(guān)節(jié)軟骨損傷。 目的：利用藻酸鹽做為載體材料，將經(jīng)過Sox9基因修飾的BMSCs植入兔關(guān)節(jié)軟骨損傷區(qū)，觀察修復(fù)效果，探索軟骨損傷修復(fù)的新途徑。 方法：在兔膝關(guān)節(jié)股骨內(nèi)側(cè)髁負重區(qū)關(guān)節(jié)面制作直徑4mn全層關(guān)節(jié)軟

14、骨損傷模型。24兔48膝隨機分為3組，以藻酸鹽做為載體材料，Ⅰ組(實驗組)植入經(jīng)Sox9基因修飾的BMSCs—藻酸鈣復(fù)合物，Ⅱ組(實驗對照組)植入未經(jīng)過基因轉(zhuǎn)染的BMSCs—藻酸鈣復(fù)合物，Ⅲ組(空白載體對照組)植入不含細胞的藻酸鈣珠。分別于術(shù)后6周、12周時處死動物，做大體觀察，HE染色和免疫組織化學染色，使用wakitani半定量評分系統(tǒng)對修復(fù)組織進行評分，觀察關(guān)節(jié)軟骨損傷的修復(fù)情況。 結(jié)果：術(shù)后6周，Ⅰ組關(guān)節(jié)軟骨損傷區(qū)大多由

15、透明樣軟骨樣修復(fù)組織填充，色澤與周圍正常軟骨組織基本接近，表面光滑，與周圍軟骨組織結(jié)合良好；Ⅱ組標本缺損區(qū)多數(shù)由纖維樣軟骨組織填充，表面光滑，與周圍正常組織之間結(jié)合較好但界限清晰；Ⅲ組標本缺損區(qū)由無細胞的藻酸鹽材料填充，多數(shù)材料填充區(qū)表面凹陷不光滑，修復(fù)區(qū)與周圍軟骨之間結(jié)合差，二者間界限清晰。術(shù)后12周，Ⅰ組標本軟骨缺損區(qū)域由透明樣軟骨填充，修復(fù)組織內(nèi)細胞呈現(xiàn)出柱狀排列的趨勢，修復(fù)組織表面光滑，與周圍正常軟骨組織的結(jié)合良好，軟骨下骨板修

16、復(fù)良好，與周圍軟骨間界限已不清晰；Ⅱ組標本大多由纖維軟骨組織填充，修復(fù)組織表面不光滑，與周圍軟骨出現(xiàn)明顯裂隙，多數(shù)標本軟骨下骨板僅部分修復(fù)；Ⅲ組標本與6周時無明顯變化。Ⅱ型膠元免疫組織化學染色顯示實驗組修復(fù)組織Ⅱ型膠原免疫組化染色陽性，證實產(chǎn)生的修復(fù)組織為透明樣軟骨。組織學評分結(jié)果顯示實驗組軟骨損傷修復(fù)效果明顯優(yōu)于兩對照組。 結(jié)論：以藻酸鹽做為載體材料負載經(jīng)體外Sox9基因修飾的BMSCs可有效地修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨損傷，與對照組相比

17、Sox9基因修飾組軟骨缺損得到了良好的填充，修復(fù)組織為透明樣軟骨，修復(fù)組織與周圍正常軟骨之間結(jié)合良好，為臨床治療關(guān)節(jié)軟骨損傷提供了新的方法和途徑。 總結(jié)：利用密度梯度離心和差速貼壁培養(yǎng)法可迅速高效地分離和純化兔骨髓間充質(zhì)干細胞，體外培養(yǎng)8代以內(nèi)的兔骨髓間充質(zhì)干細胞均具有較強的增殖能力強，可以作為軟骨組織工程研究的種子細胞。體外傳代培養(yǎng)對BMSCs的成骨和成脂肪分化能力無明顯影響，但是其成軟骨分化的能力出現(xiàn)下降。進行軟骨組織工程及基