微生物轉(zhuǎn)化L-苯丙氨酸生成2-苯乙醇的研究.pdf

1、2-苯乙醇(2-苯基乙醇)是最重要的香味物質(zhì)之一，具有玫瑰特有的香氣，廣泛應(yīng)用于食品、糖果、飲料、香料、化妝品等行業(yè)。隨著人們?cè)絹?lái)越關(guān)心健康與和營(yíng)養(yǎng)，崇尚“綠色”、“天然”，美國(guó)和歐盟等紛紛對(duì)化學(xué)食品添加劑的使用進(jìn)行了嚴(yán)格的限制規(guī)定，天然2-苯乙醇的需求量越來(lái)越大。從玫瑰花中提取的天然2-苯乙醇價(jià)格昂貴，生產(chǎn)量少，成本高，原料受多方因素限制，不能滿足人們?nèi)找嬖鲩L(zhǎng)的需求。利用微生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)天然2.苯乙醇具有周期短、成本價(jià)格低、可獲得天然

2、等同產(chǎn)品等優(yōu)點(diǎn)，是具有發(fā)展前途的替代方法之一。 本論文以酵母細(xì)胞微生物轉(zhuǎn)化L-苯丙氨酸生成2-苯乙醇為進(jìn)行了研究，主要研究?jī)?nèi)容包括：搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化；釀酒酵母的細(xì)胞固定化及其反復(fù)分批生物轉(zhuǎn)化；兩相體系生物轉(zhuǎn)化L-苯丙氨酸生成2-苯乙醇。 首先從釀酒酵母、馬克斯克魯維酵母和中國(guó)克魯維酵母這三種被報(bào)道用于轉(zhuǎn)化L-苯丙氨酸生成2-苯乙醇的最多的菌種中篩選出轉(zhuǎn)化能力最強(qiáng)的釀酒酵母作為后面的實(shí)驗(yàn)菌種。研究了釀酒酵母轉(zhuǎn)化L-苯

3、丙氨酸生成2-苯乙醇的液體發(fā)酵的營(yíng)養(yǎng)條件，確定了蔗糖為該轉(zhuǎn)化菌株的最佳碳源，最佳液體培養(yǎng)基條件(g/L)：蔗糖40，L-苯丙氨酸7，磷酸氫二鈉0.5，YNB1.8。蔗糖和L-苯丙氨酸對(duì)轉(zhuǎn)化發(fā)酵的影響較大，其次為磷酸氫二鈉和YNB。由于培養(yǎng)基成分YNB的添加使得發(fā)酵培養(yǎng)基中硫酸鎂含量達(dá)到要求，繼續(xù)添加反而會(huì)使2-苯乙醇產(chǎn)量降低，因此本實(shí)驗(yàn)發(fā)酵培養(yǎng)基中不添加硫酸鎂。實(shí)驗(yàn)得出了微生物轉(zhuǎn)化2-苯乙醇生產(chǎn)2-苯乙醇適宜的搖瓶條件為：種子培養(yǎng)時(shí)間為

4、24h，接種量6％，優(yōu)化培養(yǎng)基初始pH為4.0，裝液量為50mL/250mL，在30℃時(shí)于轉(zhuǎn)速100r/min的往復(fù)式搖床上培養(yǎng)，在此條件下發(fā)酵48h后，發(fā)酵液中2-苯乙醇含量可達(dá)到2.0g/L，比優(yōu)化前(1.5g/L)提高了33.33％。 分別用角叉膠、海藻酸鈉、明膠這3種不同載體進(jìn)行包埋法固定化細(xì)胞的試驗(yàn)。經(jīng)比較，就強(qiáng)度和2-苯乙醇的生成而言，采用海藻酸鈣包埋法均優(yōu)于其它包埋法，且該操作條件簡(jiǎn)單，容易控制固定化膠珠小球的大小

5、，而明膠凝固后需要切塊。因此，選用海藻酸鈉作為載體，進(jìn)行固定化細(xì)胞的條件實(shí)驗(yàn)。然后采用海藻酸鈣包埋法對(duì)釀酒酵母細(xì)胞進(jìn)行了固定化研究，確定固定化條件為海藻酸鈉4.0％，細(xì)胞量20％，硬化用Ca2+濃度0.1mol/L。通過(guò)對(duì)固定化細(xì)胞性質(zhì)的研究發(fā)現(xiàn)，其最佳反應(yīng)pH3.5，比游離細(xì)胞(pH4.0)偏移了0.5，最佳反應(yīng)溫度30℃，最佳反應(yīng)時(shí)間48h，與游離細(xì)胞一致。游離細(xì)胞和固定化細(xì)胞在各pH下都較穩(wěn)定。固定化細(xì)胞保藏的酶活半衰期超過(guò)10d

6、，在貯存前5d內(nèi)，固定化細(xì)胞的轉(zhuǎn)化能力沒(méi)有明顯下降，其貯存穩(wěn)定性較好。而游離細(xì)胞貯存穩(wěn)定性較差，其轉(zhuǎn)化能力隨貯存時(shí)間直線下降，其酶活半衰期不足5d。對(duì)固定化細(xì)胞的反復(fù)分批生物轉(zhuǎn)化進(jìn)行了研究，以48h作為一個(gè)周期，固定化細(xì)胞使用的半衰期約為5次，比游離細(xì)胞多2次。 為了解決2-苯乙醇的產(chǎn)物抑制問(wèn)題，對(duì)兩相體系微生物轉(zhuǎn)化L-苯丙氨酸生成2-苯乙醇進(jìn)行了研究。對(duì)庚烷、辛烷、壬烷和油酸等這集中常見(jiàn)的有機(jī)溶劑進(jìn)行了比較。結(jié)果表明，油酸不但