玉米胚乳特異性啟動(dòng)子的克隆與表達(dá)分析.pdf

1、玉米胚乳中存在著大量與淀粉合成酶、醇溶蛋白合成酶、谷蛋白合成酶相關(guān)的基因，并且有部分受胚乳特異性啟動(dòng)子調(diào)控，只在胚乳中特異性表達(dá)。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的快速發(fā)展及轉(zhuǎn)基因研究領(lǐng)域的不斷擴(kuò)大，對(duì)組織特異性啟動(dòng)子的研究逐步受到重視。本研究旨在從玉米自交系18-599紅中克隆淀粉合成酶基因ZMGBSS、谷蛋白基因ZMGT1、SC3以及醇溶蛋白基因ZEIN、BN15D14A的啟動(dòng)子GBSS、GT、SC、ZEIN、BN，對(duì)其表達(dá)的組織特異性及外界誘導(dǎo)因素

2、進(jìn)行分析，構(gòu)建了這些啟動(dòng)子的瞬時(shí)表達(dá)載體，利用基因槍法通過轉(zhuǎn)化胚乳，分析其啟動(dòng)活性。研究結(jié)果如下:
　　1、利用高保真酶KOD Fx從玉米自交系18-599紅基因組DNA成功克隆出2000bp左右的胚乳特異性啟動(dòng)子GBSS、GT、SC、ZEIN、BN序列，并對(duì)克隆片段進(jìn)行回收測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果與NCBI上B73的基因組信息比對(duì)，其相似性分別為97％、99％、99％、97％和99％。
　　2、提取玉米自交系18-599紅授粉15

3、天后的胚乳和胚以及出苗10天后的根和葉的RNA，反轉(zhuǎn)錄成eDNA，以18s rRNA作為內(nèi)參對(duì)ZMGBSS、ZMGT1、SC3、ZEIN、BN15D14A基因進(jìn)行半定量PCR分析，結(jié)果表明，ZMGBSS和ZEIN在胚乳的表達(dá)量明顯高于在其他組織。而ZMGT1、SC3、BN15D14A沒有表現(xiàn)出明顯的組織特異性。
　　3、通過熒光實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)基因ZMGBSS、ZMGT1、SC3、ZEIN、BN15D14A受外源激素誘導(dǎo)后的表達(dá)進(jìn)

4、行分析，結(jié)果表明，ABA誘導(dǎo)可導(dǎo)致基因ZMGBSS和ZEIN的表達(dá)量明顯提高。蔗糖誘導(dǎo)可導(dǎo)致基因ZMGT1和BN15D14A的表達(dá)量明顯提高。
　　4、構(gòu)建了啟動(dòng)子GBSS、GT、SC、ZEIN和BN的瞬時(shí)表達(dá)載體，即pGBSS-Lue、pGT-Lue、pSC-Lue、pZEIN-Lue和pBN-Lue，同時(shí)構(gòu)建了瞬時(shí)表達(dá)載體pUbi-Lue作為對(duì)照，構(gòu)建了瞬時(shí)表達(dá)載體pUbi-Gus作為內(nèi)參，內(nèi)參對(duì)照主要用來消除不同轉(zhuǎn)化所導(dǎo)致的

5、差異。將內(nèi)參載體與目的載體按照質(zhì)量比為1∶4的比例混合，基因槍轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化材料為4小時(shí)預(yù)處理過后的授粉15天后18-599紅的胚乳。結(jié)果表明，啟動(dòng)子GBSS、ZEIN和BN的啟動(dòng)活性相對(duì)高于SC和BN，但均明顯低于組成型啟動(dòng)子Ubiquitin。
　　5、在外源因素誘導(dǎo)表達(dá)分析中，轉(zhuǎn)化受體材料分別為葡萄糖、蔗糖、ABA和GA誘導(dǎo)4h后的胚乳，利用基因槍轉(zhuǎn)化法，按照內(nèi)參載體與目的載體以1∶4的比例混合進(jìn)行轉(zhuǎn)化，結(jié)果表明，受到ABA誘導(dǎo)