二硫鍵對(duì)菌絲霉素抗菌活性的影響及菌絲霉素多聚體在畢赤酵母中的表達(dá).pdf

1、菌絲霉素(Plectasin)是一種真菌防御素,它對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌具有高效殺傷作用,能有效地抑制肺炎鏈球菌特別是具有青霉素抗性的肺炎鏈球菌的生長(zhǎng),對(duì)其殺菌速率與萬(wàn)古霉素和青霉素相當(dāng),并且對(duì)人血紅細(xì)胞無(wú)溶血性,是極具潛力的抗感染藥物。
　　 為進(jìn)一步研究二硫鍵對(duì)Plectasin抑菌活性的影響,將本研究室已構(gòu)建成功的含有Plectasin二硫鍵突變體的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入畢赤酵母X-33中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。Tricine SDA-PAGE

2、分析發(fā)現(xiàn)各突變體均有表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)葡聚糖凝膠G-25純化后,對(duì)各個(gè)突變體的抑菌活性進(jìn)行鑒定,比較抑菌圈大小發(fā)現(xiàn),C15-C37二硫鍵對(duì)Plectasin抗菌活性影響較大,突變體(C15／37A)Plectasin和(C4／15／30／37A)Plectasin抑菌活性幾乎全部喪失；C19-C39二硫鍵對(duì)Plectasin的抗菌活性影響較小,凡是C19-C39二硫鍵發(fā)生突變的突變體抗菌活性均末喪失,但活性與未突變的Plectasin相比

3、活性都降低。
　　 多聚體串聯(lián)表達(dá)有利于提高多肽的表達(dá)量,而且以多聚體形式的多肽更加穩(wěn)定。本實(shí)驗(yàn)嘗試在畢赤酵母中融合表達(dá)Plectasin多聚體。
　　 首先,在畢赤酵母X-33中融合表達(dá)單體Plectasin。在本實(shí)驗(yàn)室已優(yōu)化的Plectasin基因兩側(cè)設(shè)計(jì)了同尾酶XbaⅠ／NheⅠ酶切位點(diǎn),以便于后續(xù)多聚體的構(gòu)建。在Plectasin多肽和載體蛋白之間分別設(shè)計(jì)了甲酸或羥胺切割位點(diǎn),以獲得目的蛋白。將設(shè)計(jì)的單體基因重組

4、到載體pPICZαA上,轉(zhuǎn)入畢赤酵母X-33中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。誘導(dǎo)表達(dá)120h后,X-33(pPICZαA／PPD)分泌表達(dá)的總蛋白濃度達(dá)339μg／mL,X-33(pPICZαA／PN)分泌表達(dá)的總蛋白濃度達(dá)307μg／mL。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)鎳柱純化、化學(xué)試劑切割后,進(jìn)行抑菌活性鑒定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)切割后獲得的單體PPD和PN均可以抑制金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng),為下一步多聚體的構(gòu)建奠定了基礎(chǔ)。
　　 在單體表達(dá)研究基礎(chǔ)上,采用同尾酶構(gòu)建法構(gòu)建了

5、Plectasin多聚體。以獲得的單體重組載體為基礎(chǔ),對(duì)重組載體分別進(jìn)行雙酶切和單酶切,具有相同粘性末端的線性載體和插入片段再連接。如此重復(fù)構(gòu)建了Plectasin二聚體和四聚體。將各多聚體誘導(dǎo)表達(dá),Tricine SDA—PAGE分析發(fā)現(xiàn)只有二聚體表達(dá),四聚體沒有表達(dá),因?yàn)榭赡苁潜磉_(dá)條件不理想,需要進(jìn)行進(jìn)一步的摸索。
　　 綜上,本研究通過對(duì)Plectasin二硫鍵突變體抑菌活性的鑒定和比較發(fā)現(xiàn),二硫鍵對(duì)Plectasin最大