凡納濱對蝦血藍(lán)蛋白蛋白質(zhì)翻譯后修飾水平多樣性的研究.pdf

1、我國是世界上最大的對蝦養(yǎng)殖生產(chǎn)國，但近年來傳染性疾病特別是病毒性病和細(xì)菌性病給對蝦養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大損失，故深入研究對蝦自身免疫抗病機制，對實現(xiàn)對蝦健康養(yǎng)殖的目的具有重要意義。有趣的是，近年來發(fā)現(xiàn)存在于對蝦血淋巴中的輸氧蛋白——血藍(lán)蛋白（hemocyanin, HMC）還具有抗病毒、抑菌等多種免疫學(xué)功能，尤其是最近課題組發(fā)現(xiàn)其功能多樣性的分子機制可能與其分子多態(tài)性有關(guān)，但其在蛋白質(zhì)翻譯后修飾水平是否存在多態(tài)性的研究尚不深入。為此，本研究以

2、凡納濱對蝦血藍(lán)蛋白為研究對象，在課題組已有研究的基礎(chǔ)之上，對其糖基化、磷酸化修飾進(jìn)行了較為深入的探討，所獲研究結(jié)果如下：
　　1、對蝦血藍(lán)蛋白糖基修飾多樣性分析
　　首先，采用不同層析技術(shù)組合獲得5種不同的HMC成分，即S-HMC（分子篩層析）、A-HMCs和A-HMCl（親和層析）、AL-HMCs和AL-HMCl（親和層析-ConA凝集素柱層析串聯(lián)）。2-DE分析顯示，該5種HMC在2-D圖譜上分別表現(xiàn)為9、6、6、7、6

3、個等電點和分子量大小存在差異的蛋白質(zhì)點。在此基礎(chǔ)之上，進(jìn)一步選用4種凝集素（ConA， PNA，UEA和DBA）對其進(jìn)行2-D凝集素印跡分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同HMC對4種凝集素的識別存在較大差異。如，S-HMC9個蛋白點中僅有5個蛋白點可與ConA發(fā)生特異性結(jié)合，但全部蛋白質(zhì)點均可識別其它3種凝集素；A-HMCs6個蛋白點均可與ConA和PNA相結(jié)合，但僅有4、3個點與UEA和DBA反應(yīng)呈陽性；AL-HMCl6個蛋白點均可被 ConA和U

4、EA所識別，但僅有2、4個點與PNA和DBA特異性顯色。
　　繼而，通過玻片凝集技術(shù)對該5種HMC的免疫學(xué)功能進(jìn)行對比分析。結(jié)果顯示，不同 HMC對不同病原菌的凝集活性存在較大差異，其凝集活性大小順序大致為S-HMC　　最后，運用病原脅迫的方

5、法比較不同病原脅迫下 HMC糖基化修飾變化的情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同病原刺激可導(dǎo)致 HMC的糖基化修飾程度發(fā)生不同程度的變化，其中副溶血弧菌、大腸桿菌刺激對蝦24h后，與對照組相比，其對ConA的識別強度降低0.5倍和0.68倍，而在相同條件下乙型鏈球菌刺激可使HMC對ConA的識別強度升高1.5倍。
　　2、對蝦血藍(lán)蛋白磷酸化多樣性的研究
　　首先，采用免疫印跡分析HMC的磷酸化修飾情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HMC9個蛋白點中分別存在4

6、、3點與anti-Ser、-Tyr抗體發(fā)生特異性結(jié)合。
　　繼而，運用生物質(zhì)譜技術(shù)對其磷酸化位點進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示，S-HMC，A-HMCs、AL-HMCs分別存在4（S-112，S-251，Y-253，S-308）、5（S-251，Y-253，S-308，T-475， T-490）和5（T-242，Y-253，T-274，Y-400，S-524）個磷酸化位點。有意思的是，與S-HMC相比，A-HMCs、AL-HMCs磷酸化位點的

7、相似率分別僅為60、20％，推測可能與血藍(lán)蛋白的分子多態(tài)性有關(guān)。
　　最后，選用病原脅迫、免疫印跡等技術(shù)進(jìn)一步比較HMC磷酸化修飾對不同病原脅迫的響應(yīng)程度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對蝦 HMC3種磷酸化修飾對不同病原刺激的響應(yīng)程度存在較大差異。其中，副溶血弧菌、乙型鏈球菌刺激對蝦后，其HMC的Ser，Thr修飾情況會隨時間的延長而減弱，而大腸桿菌刺激后其變化規(guī)律正好相反。如副溶血弧菌、大腸桿菌刺激對蝦24h后，其HMC的Ser修飾程度分別為1h