ABO血型正反定型蛋白質(zhì)芯片的構(gòu)建及應(yīng)用研究.pdf

1、在獻(xiàn)血及輸血過程中，ABO和RhD血型鑒定及HIV-1、HIV-2、HBV、HCV和Syphilis的檢測是國家強(qiáng)制性檢測項(xiàng)目。目前血型檢查采用平板法，血液病原微生物則用ELISA法檢測。現(xiàn)行檢測方法的主要缺陷是不能同步檢測，而且測試時間長、耗費(fèi)試劑多。而芯片技術(shù)由于具有高通量、可平行檢測、用時少、節(jié)省試劑、易于實(shí)現(xiàn)自動化等優(yōu)點(diǎn)，已日益引起醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域的關(guān)注。本研究擬構(gòu)建可對ABO血型進(jìn)行正反定型的蛋白質(zhì)芯片，并檢驗(yàn)其靈敏度、準(zhǔn)確性以及

2、穩(wěn)定性，以便為構(gòu)建包括ABO、Rh血型正反定型和經(jīng)血液傳播病原體檢測的蛋白質(zhì)芯片奠定基礎(chǔ)。 材料與方法 第一部分硅酸和醛基基片的優(yōu)劣對比 1.硅酸修飾基片的制作及血型抗原抗體反應(yīng)條件的優(yōu)化：將硅酸鈉溶液滴加到清潔玻片上，烘干后加入冰乙酸液，在玻片表面形成硅酸薄膜以制備成硅酸基片。包被抗-A、抗-B于硅酸基片上，并作陰性對照1(未經(jīng)硅酸修飾處)加血型抗體、陰性對照2(經(jīng)硅酸修飾處)加生理鹽水。然后放入濕盒，4℃保存

3、過夜。然后加入2％的對應(yīng)RBC生理鹽水混懸液室溫反應(yīng)5min，用PB(pH8.0)沖洗后，立即在顯微鏡下計數(shù)RBC。 在3min、5min、10min的反應(yīng)時間、24℃和37℃的反應(yīng)溫度以及pH5.7、6.5、7.0、7.5、8.0的條件下進(jìn)行組合，并分為20個實(shí)驗(yàn)組，每組進(jìn)行4次實(shí)驗(yàn)。計數(shù)已包被血型抗體的硅酸基片結(jié)合的紅細(xì)胞(RedBloodCells，RBC)數(shù)，取均值。 2.硅酸和醛基修飾基片包被血型抗體的比較：將

4、0.4μl血型抗體分別包被在硅酸和醛基修飾的玻片上，然后加入對應(yīng)的2％RBC生理鹽水混懸液與之反應(yīng)，經(jīng)PB沖洗后，立即在顯微鏡下計數(shù)10個低倍視野下的RBC數(shù)，以求出RBC的均值/低倍視野。 3.包被抗原的硅酸和醛基基片結(jié)合熒光標(biāo)記抗體的比較：將不同稀釋倍數(shù)的兔血清分別包被在硅酸和醛基修飾的玻片上，用熒光標(biāo)記的山羊抗兔IgG與之反應(yīng)，通過光譜掃描儀檢測出的熒光信號強(qiáng)度，比較兩種不同玻片對抗體吸附能力的強(qiáng)弱、熒光染色背景的高低以及

5、反應(yīng)的特異性。 第二部分醛基修飾基片構(gòu)建ABO血型正反定型檢測芯片的研究 1.ABO血型正反定型檢測芯片的構(gòu)建及重復(fù)性實(shí)驗(yàn)：將倍比稀釋的ABO血型抗體及血型物質(zhì)固定于基片。同時作如下陰、陽性對照：陰性對照組1：最低濃度血型物質(zhì)或抗體+FITC標(biāo)記的抗C1qIgG；陰性對照組2：BSA；陰性對照組3：包被5min的FITC標(biāo)記的抗C1qIgG；陽性對照：避光保存并包被了10h的FITC標(biāo)記的抗C1qIgG。 重復(fù)性

6、檢測：用新構(gòu)建的芯片對標(biāo)準(zhǔn)A型、B型RBC及抗-A、抗-BMcAb試劑進(jìn)行5次重復(fù)檢測，并計算反應(yīng)后熒光信號強(qiáng)度的變異系數(shù)。 2.ABO血型正反定型芯片檢測法的靈敏度與特異性實(shí)驗(yàn)：用包被了最高稀釋倍數(shù)達(dá)40960倍的抗體、20480倍的血型物質(zhì)的蛋白質(zhì)芯片，與對檢測試劑進(jìn)行倍比稀釋的金標(biāo)準(zhǔn)平板法分別對標(biāo)準(zhǔn)A型、B型RBC及抗-A、抗-BMcAb試劑進(jìn)行正反定型比較。 第三部分ABO血型正反定型檢測芯片的臨床應(yīng)用

7、1.芯片法同時檢測AB型RBC和O型血清：用同一芯片對AB型RBC和O型血清進(jìn)行同時檢測。 2.用芯片法對獻(xiàn)血標(biāo)本進(jìn)行ABO正反定型檢測：將20份隨機(jī)采集的健康獻(xiàn)血者的血型標(biāo)本，分別用蛋白檢測芯片進(jìn)行ABO血型正反定型的檢測。 主要結(jié)果 第一部分硅酸和醛基基片的優(yōu)劣比較 1.包被血型抗體的硅酸基片均可結(jié)合其特異性的RBC，結(jié)合的RBC數(shù)為297個/LP～367個/LP，與特異性RBC的結(jié)合率達(dá)100％；而

8、兩陰性對照結(jié)合的RBC數(shù)均為零，與特異性RBC的結(jié)合率為0％。血型抗原抗體在硅酸基片上反應(yīng)的最佳條件是：反應(yīng)溫度為24℃，pH8.0的條件下反應(yīng)5min。 2.已包被血型抗體的硅酸和醛基基片結(jié)合的RBC個數(shù)分別為332±35個/LP和257±20個/LP，前者比后者結(jié)合的RBC多29.6％。 3.硅酸基片上包括陰陽性對照在內(nèi)的全部點(diǎn)樣點(diǎn)的熒光強(qiáng)度均集中分布于42500～44900；醛基基片的兩陰性對照處熒光強(qiáng)度均值不超過

9、6800，陽性對照為43100，兔血清由80倍至10倍稀釋、濃度逐漸升高的過程中，其熒光強(qiáng)度也由33000逐漸升至41200。 第二部分ABO血型正反定型檢測芯片的構(gòu)建及效果觀察 1.三處陰性對照的熒光強(qiáng)度均不超過7200，陽性對照不低于41600。包被蛋白質(zhì)濃度逐漸升高的過程中，抗體的熒光強(qiáng)度由35600～35700逐漸升高到42300～42800；抗原的熒光強(qiáng)度也由35600～36100逐漸升高到42800～4300

10、0。五種包被蛋白質(zhì)各自的變異系數(shù)(CV)分別為：抗-A7.4％，抗-B7.0％，A物質(zhì)5.2％，B物質(zhì)5.8％，熒光標(biāo)記抗體4.7％。 2.ABO血型正反定型芯片的靈敏度，正定型為1：40960，反定型為1∶20480。平板法正定型的靈敏度為1∶256，反定型的靈敏度為1∶2。芯片法與平板法對ABO血型正反定型的符合率達(dá)100％。 第三部分ABO血型正反定型檢測芯片的臨床應(yīng)用 1.芯片中，三處陰性對照的熒光強(qiáng)度均

11、不超過8500；陽性對照42800～44000；包被蛋白質(zhì)的濃度由1024倍稀釋升至8倍稀釋的過程中，其熒光強(qiáng)度也由21000～32100逐漸升高到39000～42000。 2.掃描結(jié)果顯示：對20例標(biāo)本檢測后的芯片均呈現(xiàn)了高度的特異性，可達(dá)100％。 全文結(jié)論 1.以醛基基片為載體、成功構(gòu)建的蛋白質(zhì)芯片可以平行地對ABO血型進(jìn)行正反定型檢測，而平板法只能逐項(xiàng)進(jìn)行檢測。蛋白質(zhì)芯片法具有與金標(biāo)準(zhǔn)平板法相同的特異性，

12、而靈敏度更高。 2.如果避光存放，ABO血型正反定型芯片對檢測結(jié)果的保存可達(dá)3個月以上，而平板法只能保存數(shù)小時。 3.ABO血型正反定型蛋白質(zhì)芯片的成功建立，并采用補(bǔ)體Clq和FTTC標(biāo)記的抗C1qIgG作為反應(yīng)示蹤物，為抗原和抗體集成于同一芯片，并用同樣的標(biāo)記物指示，實(shí)現(xiàn)抗原抗體的同步檢測，提供了簡便、可行的技術(shù)方法。 4.構(gòu)建的ABO血型正反定型蛋白質(zhì)芯片是一種特異性和靈敏度較高，穩(wěn)定性較好的檢測方法，輸血檢