吉非替尼誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：通過體外實(shí)驗(yàn)研究表皮生長因子受體抑制劑吉非替尼誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞A549、H460凋亡的作用，并檢測其下游信號通路，了解靶向藥物的抗腫瘤活性，探討其中存在機(jī)制。 方法： 1.本實(shí)驗(yàn)選用兩個(gè)肺癌細(xì)胞株A549、H460為研究對象，采用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法測定兩株細(xì)胞對吉非替尼的敏感性。取對數(shù)生長期上述細(xì)胞接種96孔板，加入相應(yīng)濃度吉非替尼，72小時(shí)后加入MTT，通過多通道酶標(biāo)儀檢測各孔的吸光值A(chǔ)(波長=490nm，以

2、波長520nm為參考)。計(jì)算細(xì)胞IC50，為下一步選擇合適藥物濃度誘導(dǎo)上述細(xì)胞凋亡提供參考。 2.取20μM吉非替尼作用于A549、H460兩種肺癌細(xì)胞，加藥24小時(shí)后，甲醇固定細(xì)胞，DAPI染色后，置倒置熒光顯微鏡下觀察，觀察吉非替尼的誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡作用。 3.取對數(shù)生長期細(xì)胞，鋪25mm培養(yǎng)瓶，待細(xì)胞完全貼壁后加入不同濃度0、0.1、1.0、8.0μM吉非替尼，藥物處理細(xì)胞2h后，再加入終濃度30ng/mlEGF，

3、刺激細(xì)胞表皮生長因子受體(EGFR)及相應(yīng)下游信號的磷酸化，15min后消化細(xì)胞，用含磷酸酶抑制劑的冷PBS洗滌3次。RIPA試劑盒抽提細(xì)胞總蛋白。用Bradford蛋白分析試劑盒測量所提取蛋白的濃度。應(yīng)用Westem-Blotting方法檢測細(xì)胞加藥后EGFR及磷酸化EGFR(p-EGFR)、Akt及磷酸化Akt(p-Akt)蛋白水平變化，以GAPDH為內(nèi)參照。結(jié)果： 1.吉非替尼濃度為3、6、8、10、12.5、25、50μ

4、M時(shí)，A549細(xì)胞的增殖抑制率分別是8.26％、40.76％、45.87％、45.72％、55.69％、86.79％、95.67％；H460細(xì)胞的增殖抑制率分別是0.72％、3.44％、17.4％、12.52％、22.71％、68.91％、94.05％。該組數(shù)據(jù)表明靶向EGFR的酪氨酸激酶抑制劑吉非替尼對A549、H460細(xì)胞的增殖均有明顯的抑制作用，并且這種作用為劑量依賴性，隨藥物濃度的升高抑制率逐漸升高。吉非替尼抑制A549、H46

5、0細(xì)胞增殖的IC50分別為10.81μM，18.44μM，與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果相似。 2.取20μM吉非替尼作用于A549、H460兩種肺癌細(xì)胞，24小時(shí)后經(jīng)DAPI染色，在倒置熒光顯微鏡下觀察，光鏡下可見凋亡細(xì)胞，細(xì)胞核內(nèi)可見濃染致密的顆粒熒光，典型凋亡細(xì)胞核出現(xiàn)新月型改變，核固縮或片段化。本實(shí)驗(yàn)在體外模擬了吉非替尼的作用，觀察了靶向藥物吉非替尼誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡的作用。 3.Western-Blotting方法檢測EG

6、FR、Akt蛋白磷酸化的結(jié)果顯示：EGFR在肺癌A549和H460細(xì)胞系均有表達(dá)，在A549細(xì)胞系表達(dá)相對較高。在吉非替尼濃度為1.0μM時(shí)，兩細(xì)胞系中EGFR蛋白的磷酸化開始受到抑制，并隨著藥物濃度的增加受抑制程度逐漸明顯，當(dāng)吉非替尼濃度為8.0μM時(shí)，兩個(gè)細(xì)胞系EGFR蛋白的磷酸化幾乎完全被抑制。兩細(xì)胞系中磷酸化的Akt蛋白在吉非替尼濃度較低時(shí)即能夠受到一定程度的抑制，并隨著濃度的增加受抑制程度逐漸明顯。 本研究選取肺癌細(xì)胞

7、株A549、H460為研究對象，采用MMT法觀察兩個(gè)細(xì)胞株對吉非替尼的藥物敏感性，結(jié)果表明：吉非替尼對A549、H460細(xì)胞的增殖均有明顯的抑制作用，并且這種作用呈劑量依賴性。吉非替尼抑制A549、H460細(xì)胞增殖的IC50分別為10.81μM，18.44μM。取接近IC50值20μM吉非替尼誘導(dǎo)A549、H460細(xì)胞凋亡，經(jīng)DAPI染色后觀察到細(xì)胞核內(nèi)可見濃染致密的顆粒熒光，典型凋亡細(xì)胞核出現(xiàn)新月型改變，固縮或片段化的核，顯示了其誘導(dǎo)

8、細(xì)胞凋亡的作用。MTT實(shí)驗(yàn)和凋亡實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞水平上體外觀察了吉非替尼抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，觀察了靶向藥物吉非替尼的抗腫瘤活性。 運(yùn)用Wester-blotting方法在蛋白水平上通過EGFR和Akt磷酸化抑制實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)吉非替尼能夠抑制Akt的磷酸化，而Akt磷酸化與細(xì)胞抗凋亡能力有關(guān)，因此認(rèn)為EGFR抑制劑吉非替尼誘導(dǎo)肺癌A549、H460細(xì)胞凋亡，其分子機(jī)制可能是通過抑制Akt蛋白的磷酸化來實(shí)現(xiàn)的。 本研究有助