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1、[目的]獲得D型沙眼衣原體質(zhì)粒蛋白pgp3基因及其蛋白,制備鼠源性多克隆抗體,鑒定蛋白免疫原性。
[方法]聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增目的基因,將其插入pZeroBack載體,對(duì)pZeroBack/pgp3和原核表達(dá)載體pGEX-6p-1進(jìn)行酶切后連接,產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌DH5α,提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切、測(cè)序、PCR鑒定。再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌BL21并經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá),Western印跡鑒定目的蛋白,GST磁珠(GST M
2、agBeads)純化pgp3-谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶融合蛋白(pgp3-GST融合蛋白)。用純化后的蛋白免疫Balb/c小鼠,制備多克隆抗體,Western印跡、細(xì)胞免疫熒光鑒定抗體的特異性,間接ELISA法測(cè)定抗體滴度。
[結(jié)果]克隆目的基因測(cè)序長(zhǎng)度為795bp,序列與GeneBank中一致,Western印跡顯示目的蛋白分子量約為54000,并得到純化的蛋白。獲得鼠源性多克隆抗體,經(jīng)Western印跡和細(xì)胞免疫熒光鑒定抗體可特
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