牡丹胚性愈傷組織誘導(dǎo)及體胚發(fā)生相關(guān)基因PsSERK的克隆與表達(dá)分析.pdf

1、牡丹（Paeonia suffruticosa），為世界著名的觀賞花卉，其花朵碩大、色彩艷麗、芳香四溢，備受人們喜愛(ài)。本研究以牡丹葉柄誘導(dǎo)的愈傷組織為材料，進(jìn)行了牡丹胚性愈傷組織的誘導(dǎo)；克隆牡丹體細(xì)胞胚相關(guān)SERK基因，并采用實(shí)時(shí)熒光量PCR技術(shù)進(jìn)行了SERK基因的表達(dá)研究；采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法構(gòu)建了適用于牡丹愈傷組織的遺傳轉(zhuǎn)化體系。主要研究結(jié)果如下：
　　1.牡丹胚性愈傷組織的誘導(dǎo)
　　本試驗(yàn)選擇牡丹‘鳳丹白’和‘烏龍捧盛

2、’葉柄誘導(dǎo)的愈傷組織為材料，利用CaCl2、H2O2和硝普納（SNP，NO供體）進(jìn)行牡丹胚性愈傷組織的誘導(dǎo)，研究這3種細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子對(duì)牡丹愈傷組織生長(zhǎng)、分化的影響。通過(guò)形態(tài)學(xué)和顯微切片觀察，從總體表現(xiàn)來(lái)看，‘烏龍捧盛’在愈傷組織生長(zhǎng)過(guò)程中的褐化程度比‘鳳丹白’嚴(yán)重得多，已經(jīng)影響到愈傷的正常生長(zhǎng)和增殖。在不同濃度處理下培養(yǎng)30 d后，愈傷組織的形態(tài)上出現(xiàn)了結(jié)構(gòu)變疏松，質(zhì)地變軟，有雪花狀和凸起狀愈傷組織的形成，這些變化和胚性愈傷組織的形成

3、有關(guān)。在這3種因子中，以SNP處理下的變化最顯著。
　　通過(guò)不同時(shí)期內(nèi)酶活性和內(nèi)源激素變化的研究發(fā)現(xiàn)，CaCl2誘導(dǎo)牡丹胚性愈傷中應(yīng)保持較高濃度1.6 mmol·L-1以上，誘導(dǎo)時(shí)間約在10-20 d；H2O2在牡丹胚性愈傷組織誘導(dǎo)中的作用并不顯著；SNP在較低的濃度水平50μmol·L-1以下就可以促進(jìn)牡丹胚性愈傷的形成，并可能促進(jìn)體細(xì)胞胚的形成。
　　2.牡丹體細(xì)胞胚發(fā)生相關(guān)SERK基因的克隆與表達(dá)分析
　　本研究

4、應(yīng)用同源克隆結(jié)合 RACE技術(shù)首次從牡丹?鳳丹白‘葉柄誘導(dǎo)的愈傷組織中成功克隆得到了 SERK基因的cDNA全長(zhǎng)序列，命名為 PsSERK，在 GenBank中的注冊(cè)號(hào)為KF876175。該基因的cDNA全長(zhǎng)2362 bp，包括299 bp的5非編碼區(qū)、179 bp的3′非編碼區(qū)和1884 bp的開(kāi)放閱讀框共編碼627個(gè)氨基酸。在GenBank中檢索發(fā)現(xiàn)牡丹PsSERK基因核苷酸序列與其它植物的SERK基因序列高度同源，相似性均在82％

5、以上。
　　對(duì)牡丹PsSERK基因的生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，基因編碼627個(gè)氨基酸，屬于親水性蛋白，定位在細(xì)胞膜中，具備跨膜結(jié)構(gòu)，4個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，24個(gè)磷酸化位點(diǎn)，具有信號(hào)肽序列，二級(jí)結(jié)構(gòu)以α螺旋結(jié)構(gòu)和無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)為主。與不同植物來(lái)源的SERK的氨基酸同源性為91%-95%。
　　本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，以Actin作為內(nèi)參基因分析了在牡丹的葉子、花和胚性愈傷組織中PsSERK基因的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)變化。結(jié)果顯示該基

6、因在花中表達(dá)量最低，葉子中稍有表達(dá)，而在胚性愈傷組織中表達(dá)非常高。這表明PsSERK基因的表達(dá)與牡丹胚性愈傷的形成密切相關(guān)。
　　3.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的牡丹愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化體系構(gòu)建
　　本試驗(yàn)通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，對(duì)牡丹愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化進(jìn)行初步的研究。對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程中菌株的選擇、影響轉(zhuǎn)化率的各項(xiàng)影響因子（預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、菌液濃度、侵染時(shí)間、共培養(yǎng)時(shí)間等）進(jìn)行了初步篩選，初步建立植物組織培養(yǎng)液侵染法的牡丹愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化體系。

7、潮霉素濃度3 mg·L-1為臨界篩選濃度；頭孢霉素初始抑菌濃度為200 mg·L-1，在繼代培養(yǎng)時(shí)降低至100 mg·L-1。不經(jīng)過(guò)預(yù)培養(yǎng)，直接用OD600=0.6的菌液侵染20 min，在22℃黑暗環(huán)境下共培養(yǎng)3 d，用200 mg·L-1頭孢霉素水涮洗浸泡愈傷30 min后，接入含有100 mg·L-1頭孢霉素的液體增殖培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)24 h后，接至含有100 mg·L-1頭孢霉素和3mg·L-1潮霉素的固體篩選培養(yǎng)基中，20 d