膠原-絲素納米纖維材料肝細(xì)胞培養(yǎng)與多功能生物人工肝研究.pdf

1、人工肝主要分為非生物型人工肝、生物型人工肝。生物反應(yīng)器是生物人工肝支持系統(tǒng)的核心部分，其性能直接關(guān)系到人工肝支持的效率和效果，生物反應(yīng)器設(shè)計(jì)必須滿足兩個(gè)基本功能，一是為肝細(xì)胞提供良好的生長、代謝環(huán)境;二是為肝衰竭患者血液或血漿與肝細(xì)胞作用，進(jìn)行物資交換提供理想的場所。體外肝細(xì)胞理想的培養(yǎng)條件應(yīng)盡可能模擬體內(nèi)肝細(xì)胞生長微環(huán)境，天然細(xì)胞外基質(zhì)的膠原蛋白纖維尺寸為50～500nm，因此納米尺度、具有合適的孔尺寸、高孔隙率支架能最大程度地仿生體

2、內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)的特點(diǎn)。
　　 靜電紡絲技術(shù)制備的納米級(jí)材料比表面積大、孔隙率高，納米纖維支架與細(xì)胞外基質(zhì)在形態(tài)結(jié)構(gòu)上非常相似，作為組織工程支架材料不僅能夠起到支撐細(xì)胞的作用，還能發(fā)揮模板功能，為細(xì)胞提供黏附、生長、分化和增殖的場所。
　　 本研究采用靜電紡絲的方法，制備膠原/絲素電紡納米纖維膜，觀察其對(duì)肝細(xì)胞體外培養(yǎng)的作用，為其在人工肝生物反應(yīng)器中的應(yīng)用提供理論依據(jù);同時(shí)設(shè)計(jì)完成制作多功能生物人工肝支持系統(tǒng)，使其既具備血漿

3、置換、血液灌流、血液濾過、血液透析、連續(xù)性血液透析濾過、白蛋白透析等非生物人工肝功能，又能與生物反應(yīng)器配合使用，具備生物型人工肝功能。
　　 研究內(nèi)容如下:
　　 1，以HFIP為溶劑，以膠原蛋白、絲素蛋白為材料，通過靜電紡絲方法制備人工肝支架，研究靜電紡絲的參數(shù)設(shè)定，并對(duì)材料進(jìn)行物理、生物性能鑒定，主要包括交聯(lián)后材料表面、交聯(lián)特性、力學(xué)特性等;同時(shí)進(jìn)行大鼠皮下植入實(shí)驗(yàn)，考察材料生物學(xué)性能。
　　 2，分離提取新

4、鮮大鼠原代肝細(xì)胞，以膠原/絲素電紡納米纖維膜作為基底材料進(jìn)行體外肝細(xì)胞培養(yǎng)，考察肝細(xì)胞在材料界面上生長增殖情況。
　　 3，用已經(jīng)成熟的肝細(xì)胞系HepG2細(xì)胞進(jìn)行膠原/絲素電紡納米纖維支架材料體外肝細(xì)胞培養(yǎng)，考察已經(jīng)成熟的肝細(xì)胞株在材料界面上的生長情況。
　　 4，通過超聲振蕩方法制備膠原/絲素納米纖維微載體，將微載體與膠原凝膠細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)結(jié)合，觀察納米纖維載體/膠原凝膠復(fù)合體系對(duì)肝細(xì)胞體外培養(yǎng)的作用。
　　 5

5、，按照三重循環(huán)方式設(shè)計(jì)多功能生物人工肝支持系統(tǒng)，劃分出功能單元分模塊進(jìn)行設(shè)計(jì)。進(jìn)行樣機(jī)制作，制定產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)，完成樣機(jī)檢測。
　　 研究結(jié)果顯示:
　　 1，以HFIP為溶劑，在溶液濃度為10％，電壓為16kV，噴速為2ml/h，接收距離為12cm的條件下，膠原蛋白與再生絲素比例分別為10∶0，7∶3，5∶5，3∶7，0∶10，電紡五種配比的膠原/絲素溶液，制備的復(fù)合纖維直徑在550-1100nm之間，其中純膠原和純絲素的纖

6、維平均直徑分別為569±99nm和1058±240nm，纖維平均直徑隨著絲素含量的增加而增加。
　　 2，大鼠原代肝細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果顯示，常規(guī)培養(yǎng)組在第二天細(xì)胞數(shù)量與細(xì)胞功能達(dá)到高峰，之后迅速下降，而膠原/絲素納米纖維支架組在第二天達(dá)到高峰后，之后3-5天內(nèi)維持平穩(wěn)緩慢下降狀態(tài)，其尿素合成、蛋白分泌與常規(guī)培養(yǎng)組有明顯差別。
　　 3，HepG2細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果顯示細(xì)胞在材料表面生長狀態(tài)良好并與支架材料緊密結(jié)合。隨培養(yǎng)時(shí)間延長，常

7、規(guī)培養(yǎng)組細(xì)胞在第5天后逐漸死亡，失去細(xì)胞功能，膠原/絲素納米纖維支架組細(xì)胞在4-9天內(nèi)能夠維持穩(wěn)定狀態(tài)，其尿素合成、蛋白分泌與常規(guī)培養(yǎng)組有明顯差別，其中絲素含量為50％組的細(xì)胞狀態(tài)和細(xì)胞功能高于其它組。
　　 4，納米纖維載體/膠原凝膠復(fù)合培養(yǎng)觀察結(jié)果顯示，培養(yǎng)12d，納米纖維載體/膠原凝膠復(fù)合培養(yǎng)組白蛋白分泌功能穩(wěn)定，持續(xù)增高，于第9天達(dá)到峰值，之后緩慢下降;而膠原凝膠培養(yǎng)組培養(yǎng)液中白蛋白含量至第3天達(dá)到峰值，之后迅速下降，至

8、第6天大部分細(xì)胞死亡，失去白蛋白分泌功能。鏡下觀察納米纖維載體/膠原凝膠復(fù)合培養(yǎng)組細(xì)胞聚集于納米纖維載體周圍生長，形成聚集體，細(xì)胞維持穩(wěn)定狀態(tài)至12d;膠原凝膠培養(yǎng)組中細(xì)胞均勻分布，至培養(yǎng)第3天細(xì)胞數(shù)量到達(dá)峰值，之后細(xì)胞逐漸萎縮死亡。
　　 5，多功能生物人工肝設(shè)計(jì)圖、產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)見文章第三部分。
　　 綜上所述，采用靜電紡方法能夠制備出納米級(jí)別膠原/絲素復(fù)合纖維膜，而肝細(xì)胞在膠原/絲素電紡納米纖維膜表面貼附牢固，生長狀態(tài)良

9、好并維持功能，部分細(xì)胞向膜材料表面孔徑內(nèi)遷移，較之常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞增殖效果明顯，維持功能表達(dá)時(shí)間延長，絲素含量為50％組細(xì)胞活性最好，電紡膠原/絲素納米纖維制備成微載體后，與膠原凝膠培養(yǎng)方式結(jié)合，能夠進(jìn)一步增強(qiáng)細(xì)胞培養(yǎng)功能，復(fù)合培養(yǎng)組細(xì)胞圍繞微載體聚集生長，形成細(xì)胞聚集體，依附于微載體上肝細(xì)胞微囊包載體肝細(xì)胞形態(tài)，12d培養(yǎng)周期內(nèi)細(xì)胞生長狀態(tài)良好，12d后依然維持三維形態(tài)，細(xì)胞形態(tài)良好。膠原/絲素納米纖維材料有望用于改善人工肝生物反應(yīng)器中的