人鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體8強(qiáng)免疫原性片段的預(yù)測(cè)及原核表達(dá)鑒定.pdf

1、1型糖尿病(type1 diabetes mellitus,T1DM)是一種主要由胰島β細(xì)胞進(jìn)行性破壞所致的多因素復(fù)雜疾病,血液中多種胰島細(xì)胞自身抗體成分是其區(qū)別于其他糖尿病綜合癥的主要特點(diǎn),因而自身抗原成分檢測(cè)是準(zhǔn)確診斷T1DM及研究其致病機(jī)理的有效手段。大量臨床試驗(yàn)表明多種自身抗體與T1DM密切相關(guān),包括胰島細(xì)胞抗體(ICA)、谷氨酸脫羧酶抗體(GADA)、胰島素自身抗體(IAA)和蛋白酪氨酸磷酸酶抗體(IA2A)。這些抗體聯(lián)合檢測(cè)

2、是高危人群中比較敏感的診斷指標(biāo),但在普通人群篩查中的敏感性和特異性卻并不令人滿(mǎn)意[1,2],急需尋找新的分子靶標(biāo)以利于T1D的早期篩查診斷。
　　 人鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體8(Zinc transporter8,ZnT8)是鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體家族成員中新近發(fā)現(xiàn)的重要成員之一,定位于胰島β細(xì)胞和少量α細(xì)胞中,為胰島特異性的鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,在胰島素的分泌、合成及儲(chǔ)存過(guò)程中發(fā)揮著不可或缺的作用[3]。近期國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道通過(guò)放免法檢測(cè)了新發(fā)糖尿病患者及前驅(qū)糖尿病患者

3、血清中的自身抗原表達(dá)譜,發(fā)現(xiàn)ZnT8可作為一個(gè)新的T1DM重要預(yù)測(cè)診斷指標(biāo)。隨后大量研究證實(shí),ZnT8在T1DM的診斷中具有高度的特異性和敏感性,聯(lián)合已有的T1DM自身免疫抗體檢測(cè)指標(biāo)將極大地提高T1DM的早期檢出率,對(duì)T1DM鑒別診斷、治療監(jiān)控和預(yù)測(cè)都有著重要的臨床意義。
　　 目的：
　　 本研究通過(guò)生物信息學(xué)手段,采用DNAstar軟件對(duì)ZnT8蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)、親水性、柔韌性、表面可及性以及抗原性作綜合預(yù)測(cè),從預(yù)測(cè)

4、結(jié)果中篩選出具有強(qiáng)免疫原性的N末端片段ZnT8(N),利用基因工程技術(shù)構(gòu)建pET32a-ZnT8(N)原核表達(dá)載體,并在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)表達(dá),為進(jìn)一步探討其在糖尿病診斷中的臨床價(jià)值,深入研究其功能特點(diǎn)及在臨床診斷中的作用奠定了基礎(chǔ)。
　　 方法
　　 1.采用生物信息學(xué)軟件對(duì)ZnT8的結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè),從中篩選確定具有強(qiáng)免疫原性的N末端片段ZnT8(N)。
　　 2.根據(jù)GenBank中ZnT8基因的編碼序列,設(shè)計(jì)帶N

5、coⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)的上下游引物,以pZnT-8-EGFP質(zhì)粒為模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。
　　 3.表達(dá)載體pET32a-ZnT8(N)的構(gòu)建及鑒定
　　 4.挑選酶切、測(cè)序正確的陽(yáng)性重組質(zhì)粒pET32a-ZnT8(N)和空質(zhì)粒pET32a轉(zhuǎn)化入大腸桿菌IPTG中誘導(dǎo)表達(dá)。
　　 5.ZnT8(N)融合蛋白的Western blot鑒定
　　 結(jié)果：
　　 1.通過(guò)DNAstar軟件進(jìn)行預(yù)測(cè)

6、,發(fā)現(xiàn)ZnT8第N末端140位之前的氨基酸富含α螺旋,親水性、柔韌性以及表面可及性均較高,大部分為外膜區(qū),且抗原性分析明顯高于其他片段,表明該片段(含140個(gè)氨基酸,ZnT8)抗原性強(qiáng),因此選取該片段進(jìn)行克隆表達(dá)。
　　 2.成功構(gòu)建了pET32a-ZnT8(N)原核表達(dá)載體。
　　 3.經(jīng)超聲破菌、SDS-PAGE分析,觀察目的條帶與預(yù)計(jì)的分子質(zhì)量大小相符。
　　 4.經(jīng)免疫印跡檢測(cè)鑒定為陽(yáng)性,融合蛋白的表達(dá)量