內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在非酒精性脂肪性肝病肝細(xì)胞損傷中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、第一部分非酒精性脂肪肝患者肝功能損害與體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化水平的關(guān)系。 背景：非酒精性脂肪性肝病是一組與肥胖、胰島素抵抗有關(guān)的疾病，氧化應(yīng)激是其病情進(jìn)展的關(guān)鍵因素。為進(jìn)一步探討肥胖，高血糖，高脂蛋白血癥，氧應(yīng)激這些因素對(duì)NAFLD患者肝細(xì)胞損傷的影響，我們擬對(duì)比分析健康者與NAFLD患者血清轉(zhuǎn)氨酶的變化與MDA、GSH、GSSG以及糖脂代謝相關(guān)指標(biāo)的關(guān)系，探討脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)在NAFLD患者病情發(fā)展中的意義，以期對(duì)非酒精性脂肪性肝病的臨

2、床防治和機(jī)制探討提供依據(jù)。 方法：依據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)脂肪肝和酒精性肝病學(xué)組制定的非酒精性脂肪性肝病診療指南診斷為非酒精性脂肪性肝病的患者89例，另選正常健康體檢者30例為對(duì)照組。體檢當(dāng)天清晨空腹分別收集血清做ALT、AST、GGT水平檢測(cè)以及測(cè)定血糖、血脂、身高、體重、腰圍、臀圍等指標(biāo)參數(shù)，詳細(xì)詢問(wèn)病史完成調(diào)查問(wèn)卷，同時(shí)抽空腹血做GSH、GSSG及MDA水平檢測(cè)，分析兩組之間各指標(biāo)的差異并對(duì)各指標(biāo)與ALT、AST、GGT進(jìn)

3、行線性多元回歸分析。 結(jié)果：除年齡以及身高外，NAFLD患者與對(duì)照組的收縮壓、舒張壓、體重、BMI、腰圍、臀圍及腰臀比分別為：131.0899±16.06mmHg vs111.7667±9.6622mmHg，80.7865±10.7508mmHg vs72.1333±5.5939mmHg，27.4738±2.7044Kg/㎡vs22.348±1.4957Kg/㎡，73.6067±10.1148Kg vs60.6667±6.121

4、4 Kg，0.9888±0.0675m vs0.7497±0.0494m，1.3933±0.0606m vs0.88±0.0585m，0.985±0.0364 vs0.853±0.0197，各指標(biāo)NAFLD患者均顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。代謝指標(biāo)的分析中，NAFLD患者平均空腹血糖水平為6.9204±2.3619mol/L，甘油三酯為2.1498±1.1454mmol/L，總膽固醇為4.9415±0.9635 mmol/L，低密度

5、脂蛋白為2.7342±0.7426 mmol/L，脂肪酸為0.6481±0.1497mmol/L均顯著高于對(duì)照組（分別為：4.703±0.5628mmol/L，1.1369±0.1712mmol/L，4.2047±0.3735mmol/L，2.1693±0.2936mmol/L，0.5193±0.1095mmol/L。P<0.05），高密度脂蛋白為1.0488±0.1953 mmol/L，顯著低于對(duì)照組1.374±0.0878mmol/

6、L（P<0.05）。肝功能分析結(jié)果顯示NAFLD患者血清ALT、AST、GGT分別為55.8202±31.4638u/L，40.3258±25.947u/L及60.3933±50.9723u/L均明顯高于對(duì)照組（分別為21.7667±6.447u/L，17.7333±3.805u/L，20.3±6.984，P<0.05）。氧化應(yīng)激指標(biāo)結(jié)果顯示，NAFLD患者血清中GSSG及MDA含量分別為44.5996±8.4965μmol/L及3.4

7、401±0.6452μmol/L，比對(duì)照組26.4127±2.04μmol/L及2.2683±0.1016μmol/L明顯升高（P<0.05），而 GSH為254.2137±35.9436μmol/L比正常對(duì)照320.3693±36.5549μmol/L顯著降低（P<0.05）。多元線性回歸分析結(jié)果表明，在BMI、腰臀比、高血壓、高血糖、高血脂及氧化應(yīng)激水平等因素中，MDA、GSSG、GSH及GSH/GSSG對(duì)NAFLD患者血清轉(zhuǎn)氨酶A

8、LT、AST影響最明顯，其中，GSH及GSH/GSSG與ALT、AST成負(fù)相關(guān)（P<0.05）。對(duì)GGT影響最大的因素分別是GSSG和MDA（P<0.05），GSH及GSH/GSSG對(duì)GGT的影響沒(méi)有顯著性（P>0.05）。 結(jié)論：NAFLD是一組與肥胖和血糖、血脂代謝紊亂有關(guān)的疾病，在NAFLD患者體內(nèi)存在氧化/抗氧化穩(wěn)態(tài)的失衡，并與肝細(xì)胞損傷密切相關(guān)。多元線性回歸分析結(jié)果表明肥胖及血糖血脂異常雖然與NAFLD發(fā)病有關(guān)，但是脂

9、質(zhì)過(guò)氧化的水平才是對(duì)患者肝功能影響最大的因素。血清MDA、GSSG及GSH/GSSG水平的異?？赡苁欠从砃AFLD患者肝細(xì)胞受損的敏感的血清學(xué)指標(biāo)。第二部分軟脂酸鈉體外誘導(dǎo)肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及細(xì)胞凋亡信號(hào)通路的體外實(shí)驗(yàn)。 背景：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激由缺氧、營(yíng)養(yǎng)缺乏、氧化應(yīng)激、錯(cuò)誤合成或未折疊的蛋白質(zhì)增多等因素誘發(fā)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生后通過(guò)啟動(dòng)有關(guān)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制細(xì)胞蛋白合成，水解錯(cuò)誤合成的蛋白，并對(duì)不能修復(fù)的細(xì)胞則通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)細(xì)胞凋亡機(jī)

10、制誘導(dǎo)其凋亡以維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。研究證實(shí)過(guò)強(qiáng)和過(guò)長(zhǎng)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)通過(guò)細(xì)胞能量耗竭、鈣穩(wěn)態(tài)失衡、激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)細(xì)胞凋亡等機(jī)制使器官和組織產(chǎn)生損傷，其中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)細(xì)胞凋亡是應(yīng)激狀態(tài)下細(xì)胞損傷的主要機(jī)制。脂質(zhì)過(guò)氧化是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的誘導(dǎo)因素，軟脂酸鈉可能通過(guò)誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激造成肝細(xì)胞損傷、產(chǎn)生細(xì)胞凋亡。本部分研究擬通過(guò)軟脂酸鈉與人L02肝細(xì)胞體外共培養(yǎng)，誘導(dǎo)其產(chǎn)生脂肪變性建立非酒精性脂肪性肝病的細(xì)胞模型，分析飽和脂肪酸（軟脂酸鈉）體外對(duì)內(nèi)質(zhì)

11、網(wǎng)應(yīng)激的誘導(dǎo)情況和對(duì)肝細(xì)胞凋亡和損傷的影響，并探討軟脂酸鈉誘導(dǎo)肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后細(xì)胞凋亡可能的信號(hào)途徑。 方法：以人正常肝細(xì)胞L02細(xì)胞系為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，不加任何處理因素為正常對(duì)照組，用軟脂酸鈉處理L02細(xì)胞誘導(dǎo)其產(chǎn)生脂肪變性作為模型組，軟脂酸鈉及還原性谷胱甘肽聯(lián)合處理為干預(yù)組。MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性，篩選軟脂酸鈉最佳作用濃度及時(shí)間，AnnexinⅤ/PI流式細(xì)胞儀定量檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平。同時(shí)檢測(cè)細(xì)胞及細(xì)胞上清液GSSG以及MDA含量，

12、評(píng)價(jià)脂質(zhì)過(guò)氧化水平。RT-PCR分析軟脂酸鈉處理后L02細(xì)胞ATF4 mRNA變化趨勢(shì)，western-blotting分析p-PERK、ATF4以及CHOP蛋白水平的變化，同時(shí)檢測(cè)Caspase-4活性。并用還原性谷胱甘肽為還原劑觀察干預(yù)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)后上述模型相關(guān)指標(biāo)的變化。 結(jié)果：1、用軟脂酸鈉成功誘導(dǎo)建立L02肝細(xì)胞株脂肪變性模型。光鏡下油紅“o”染色顯示，肝細(xì)胞可見(jiàn)大量橘紅色脂滴，并隨軟脂酸鈉濃度增加和時(shí)間延長(zhǎng)而更加明

13、顯。2、與正常對(duì)照組比較，模型組培養(yǎng)上清的轉(zhuǎn)氨酶（ALT、AST）水平及脂質(zhì)過(guò)氧化（GSSG、MDA）水平明顯升高，干預(yù)組的相應(yīng)指標(biāo)呈顯著下降趨勢(shì)（P<0.05）。3、MTT及凋亡率檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，L02細(xì)胞暴露在不同濃度軟脂酸鈉中的時(shí)間越長(zhǎng)，劑量越大，細(xì)胞凋亡越多，與正常對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。給予GSH干預(yù)后，可以觀察到明顯的細(xì)胞保護(hù)效應(yīng)，L02細(xì)胞凋亡率明顯下降（P<0.05）。4、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)及通路研究，在

14、模型組，L02細(xì)胞GRP78蛋白水平明顯增加，p-PERK水平在軟脂酸鈉處理12小時(shí)后開(kāi)始升高，24小時(shí)達(dá)到高峰，ATF4 mRNA表達(dá)在軟脂酸鈉作用后2小時(shí)開(kāi)始上調(diào)，12小時(shí)達(dá)到高峰，20小時(shí)以后開(kāi)始下降，ATF4蛋白水平在24小時(shí)有所增加，與正常對(duì)照比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。雖然CHOP蛋白水平也有上升趨勢(shì)，但是與正常對(duì)照組相比沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。GSH干預(yù)后，GRP78蛋白、p-PERK水平、ATF4 mR

15、NA及蛋白水平均明顯下降（P<0.05），CHOP蛋白水平也有下降趨勢(shì)，但是差異沒(méi)有顯著性（P>0.05）。在模型組，Caspase-4活性明顯升高，加入GSH后則明顯被抑制（P<0.05）。 結(jié)論：軟脂酸鈉誘導(dǎo)的脂肪變肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是介導(dǎo)非酒精性肝病肝細(xì)胞損傷的重要事件。軟脂酸鈉通過(guò)上調(diào)GRP78表達(dá)，啟動(dòng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡。外源性補(bǔ)充抗氧化劑可以降低脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激程度，減弱軟脂酸鈉對(duì)肝細(xì)胞的毒性。內(nèi)質(zhì)