豬α干擾素在畢赤酵母中的分泌表達(dá)及其免疫佐劑功能研究.pdf

1、我國(guó)是一個(gè)養(yǎng)豬大國(guó)，但目前有多種傳染病嚴(yán)重危害著我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，影響了我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展和豬肉的對(duì)外貿(mào)易。因此，急需研制出安全、高效、新型的抗病毒和免疫增強(qiáng)劑用于增強(qiáng)豬體的抵抗力和提高現(xiàn)有疫苗的保護(hù)率。干擾素(Interferon，IFN)是動(dòng)物機(jī)體感染病毒或接種疫苗后產(chǎn)生的一類(lèi)具有抗病毒和免疫調(diào)節(jié)功能的蛋白質(zhì)，是動(dòng)物抵御病毒入侵的第一道防線。根據(jù)干擾素的氨基酸序列、抗原性和細(xì)胞來(lái)源的不同可將其分為2個(gè)型：Ⅰ型干擾素的主要成員為α干擾素

2、和β干擾素，Ⅱ型干擾素為γ干擾素。Ⅰ型干擾素具有較強(qiáng)的抗病毒功能，Ⅱ型干擾素抗病毒功能稍弱，但免疫調(diào)節(jié)功能較強(qiáng)。人類(lèi)重組干擾素用于治療病毒感染和腫瘤疾病已有幾十年的成功歷史。近年來(lái)，豬干擾素(Porcine interferon，PoIFN)的抗病毒和疫苗佐劑功能也在更多的試驗(yàn)中被發(fā)現(xiàn)和證實(shí)。本研究的目的就是應(yīng)用基因工程和蛋白質(zhì)工程技術(shù)研制出具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的重組豬α干擾素并研究其抗病毒和免疫佐劑功能，為我國(guó)重組豬干擾素的工程化生產(chǎn)及其

3、在養(yǎng)豬業(yè)中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。 將豬α干擾素(PoIFNα)基因克隆入畢赤酵母分泌型表達(dá)載體pPICZα-A中，電轉(zhuǎn)化畢赤酵母X-33菌株，抗生素ZeocinTM濃度梯度篩選高抗性轉(zhuǎn)化子，以PCR鑒定陽(yáng)性重組菌株。篩選出的高拷貝重組菌株分別通過(guò)BMGY/BMMY培養(yǎng)，用甲醇誘導(dǎo)表達(dá)獲得重組PoIFNα表達(dá)產(chǎn)物，經(jīng)微量細(xì)胞病變抑制試驗(yàn)(MDBK-VSV系統(tǒng))檢測(cè)，表達(dá)產(chǎn)物的抗病毒活性為2×10<'6>U/mL。 為了探討酵母

4、表達(dá)的豬α干擾素的抗病毒活性，本研究試驗(yàn)了重組豬α干擾素在MDBK細(xì)胞、PK-15細(xì)胞和Marc-145細(xì)胞上對(duì)水皰性口炎病毒的抗病毒效價(jià)，同時(shí)探討重組豬α干擾素對(duì)豬繁殖與呼吸綜合癥病毒(PRRSV)和偽狂犬病毒(PRV)的抗病毒效果。結(jié)果顯示，重組豬α干擾素在MDBK細(xì)胞上對(duì)VSV病毒的抗病毒效價(jià)最高，約為106.5U/mL,比重組豬α干擾素在Marc-145細(xì)胞和PK-15細(xì)胞上對(duì)VSV病毒的抗病毒效價(jià)要高100～1000倍，推測(cè)不

5、同細(xì)胞上豬α干擾素受體的分布具有較大的差異。偽狂犬強(qiáng)毒株RA株和天然弱毒株Bartha株在1000U/mL豬α干擾素處理的PK-15上的增殖均被顯著抑制，病毒TCID<,50>下降約10倍，但強(qiáng)弱毒之間的敏感性沒(méi)有明顯差異。豬α干擾素對(duì)豬繁殖與呼吸綜合癥病毒(PRRSV)和偽狂犬病毒(PRV)在細(xì)胞上的增殖具有顯著的抑制效果，可使病毒TCID<,50>下降約100倍。PRRSV VR2332株和國(guó)內(nèi)JS06分離株對(duì)豬α干擾素的敏感性沒(méi)有

6、明顯差異?？傊亟M豬α干擾素顯示了良好的抗病毒活性。研究評(píng)估酵母表達(dá)的PCV2 Cap蛋白在豬體的免疫特性以及豬α干擾素對(duì)其的免疫佐劑效果。將酵母表達(dá)的PCV2 Cap蛋白濃縮后，配比適量的鋁膠或重組豬α干擾素制成亞單位疫苗。試驗(yàn)仔豬分組后分別免疫鋁膠亞單位疫苗和添加豬α干擾素的鋁膠亞單位疫苗，同時(shí)設(shè)攻毒對(duì)照與空白對(duì)照，首免后21天加強(qiáng)免疫一次，二免疫后14天用PCV2 JS攻毒。鋁膠Cap蛋白亞單位疫苗免疫豬體后產(chǎn)生了PCV2特異性

7、中和抗體。添加豬α干擾素亞單位疫苗組仔豬免疫后產(chǎn)生的ELISA抗體和中和抗體顯著高于鋁膠亞單位疫苗組仔豬。攻毒對(duì)照組的4只仔豬攻毒后全都產(chǎn)生了病毒血癥，并有較長(zhǎng)時(shí)間的發(fā)熱；鋁膠亞單位疫苗組4頭仔豬中只有1頭仔豬產(chǎn)生病毒血癥，添加豬α干擾素亞單位疫苗組的仔豬攻毒后都沒(méi)有產(chǎn)生病毒血癥。綜合分析試驗(yàn)豬的病毒感染、臨床表現(xiàn)和生產(chǎn)性能等情況表明Cap蛋白亞單位疫苗具有免疫保護(hù)效果，豬α干擾素可顯著增強(qiáng)Cap蛋白亞單位疫苗接種仔豬的體液免疫反應(yīng)，提