P53對缺血再灌注損傷后腎小管上皮細(xì)胞演變的調(diào)控作用及其機制研究.pdf

1、臨床上，急性腎功能衰竭(Acute renal failure，ARF)的發(fā)生率居高不下，美國成人ARF年發(fā)生率為0.02％，普通病房．ARF發(fā)生率為5％，而ICU病房ARF的發(fā)生率則高達30-50％，而且應(yīng)激條件下，老年人群ARF的易感性更高。ARF不僅嚴(yán)重危及人類生命和生活質(zhì)量，而且給社會帶來沉重的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。腎缺血再灌注損傷(Renalischemia-reperfusion injury，IRI)是自體腎發(fā)生ARF的主要原因，而在

2、移植腎無一例外的要發(fā)生ARF。IRI急性期主要的病理改變是腎小管損害，表現(xiàn)為腎小管壞死和腎小管上皮細(xì)胞凋亡，這種損害不僅是腎臟急性功能障礙的病理基礎(chǔ)，而且還對腎臟結(jié)構(gòu)和功能的改變產(chǎn)生長期效應(yīng)(Long-term effects)，其中IRI后的氧化應(yīng)激等因素，可造成細(xì)胞．DNA損傷并激活細(xì)胞衰老信號通路，引起細(xì)胞衰老。推測一方面，IRI誘導(dǎo)和加速腎小管上皮細(xì)胞衰老可能是產(chǎn)生這種長期效應(yīng)的重要原因之一；另一方面，自然衰老的腎小管上皮細(xì)胞在

3、IRI作用下可能更易走向死亡(壞死和凋亡)，成為老年人群ARF易感性增高的重要原因。由于p53是重要的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白之一，細(xì)胞在p53的影響下是選擇死亡還是分裂阻滯(衰老)，可能與p53的表達水平、細(xì)胞所處的周圍環(huán)境以及不同的p53靶基因激活有關(guān)。 本研究旨在探討腎臟IRI后，腎小管上皮細(xì)胞的急性和慢性演變特征、以及p53對這種演變的調(diào)控作用和相關(guān)機制，為ARF和衰老相關(guān)性腎臟疾病的防治提供理論依據(jù)。 本課題研究包括以

4、下四個部分： 第一部分缺血再灌注損傷后腎小管上皮細(xì)胞的演變及其意義 1．目的：觀察。腎臟缺血再灌注損傷(IRI)后正常和衰老腎小管上皮細(xì)胞的演變，探討細(xì)胞衰老在衰老相關(guān)性腎臟病理變化中的作用。 2．方法：以低齡(2m齡)和高齡(12m齡)野生鼠為研究對象，建立左腎IRI模型。于IRI后0d、1d、3d、7d、1m、3m、6m，用HE染色觀察腎小管組織學(xué)變化，免疫熒光法檢測腎小管上皮細(xì)胞增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)的

5、表達，組織化學(xué)染色觀察腎小管上皮細(xì)胞衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶(sA-β-gal)的活性，TUNEL法檢測凋亡腎小管上皮細(xì)胞。 3．結(jié)果：腎臟IRI后0d，腎小管以壞死為主，高齡鼠比低齡鼠更為明顯(P<0.05)。IRI 1d后出現(xiàn)腎小管上皮細(xì)胞凋亡，7d時凋亡達到高峰(P<0.05)，且在同一時間點，高齡鼠比低齡鼠嚴(yán)重(P<0.05)。低齡鼠IRI腎1m時出現(xiàn)腎小管上皮細(xì)胞衰老，而對側(cè)腎沒有出現(xiàn)，3m、6m點衰老細(xì)胞顯著增多(

6、P<0.05)；高齡鼠IRI后0 d雙腎均可見大量衰老的腎小管上皮細(xì)胞，但IRI腎的衰老細(xì)胞在IRI 1d后明顯減少(P<0．05)，1m后又逐漸增多，只是仍較對側(cè)腎臟少，但卻較同時間點低齡鼠腎臟多，6m后高齡鼠雙腎衰老的。腎小管上皮細(xì)胞幾乎又達到同一水平。PCNA陽性染色細(xì)胞出現(xiàn)的幾率兩組相比沒有統(tǒng)計學(xué)差別(P>0.05)，但低齡組細(xì)胞增殖能力要強于高齡組。對高齡鼠IRI后1d點腎小管上皮細(xì)胞凋亡與衰老之間的相關(guān)分析顯示，二者存在顯著

7、負(fù)相關(guān)(r=-0.82，P<0.001)。 4．結(jié)論：①IRI可促進正常腎小管上皮細(xì)胞衰老的進程；②已經(jīng)進入衰老狀態(tài)的腎小管上皮細(xì)胞在遭受IRI刺激后，更易走向死亡(壞死和/或凋亡)。腎小管上皮細(xì)胞的這種演變，在老化相關(guān)性腎臟病理變化發(fā)生和進展中可能發(fā)揮著重要作用。 第二部分p21對缺血再灌注損傷后腎小管上皮細(xì)胞演變的影響 1．目的：探討p21對缺血再灌注損傷(IRI)后腎小管上皮細(xì)胞演變的影響。 2．方

8、法：選擇低齡(2月齡)和高齡(12月齡)p21(+/+)和p21(-/-)鼠，建立左腎IRI模型。于IRI后0、1、3、7d及1、3、6月光鏡下觀察腎小管組織學(xué)變化，采用免疫熒光法檢測腎小管上皮細(xì)胞增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)表達，組織化學(xué)染色觀察腎小管上皮細(xì)胞衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶(sA-β-gal)活力，末端脫氧核糖轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的生物素化脫氧尿嘧啶缺口末端標(biāo)記技術(shù)(TUNEL)檢測腎小管上皮細(xì)胞凋亡。 3．結(jié)果：IRI后0d，腎

9、小管以壞死為主，高齡鼠比低齡鼠嚴(yán)重、p21(-/-)鼠比p21(+/+)嚴(yán)重(P<0.05)。腎小管上皮細(xì)胞凋亡在1d后出現(xiàn)，7d時達到高峰，且高齡鼠比低齡鼠明顯、p21(-/-)鼠比p21(+/+)鼠明顯(P<0.05)。低齡鼠IRI后1月出現(xiàn)SA-β-Gal染色陽性的腎小管上皮細(xì)胞，而對側(cè)腎此時未見衰老細(xì)胞，3、6月時衰老的腎小管上皮細(xì)胞顯著增多、且p21(+/+)鼠比p21(-/-)鼠明顯(P<0.05)；p21(+/+)高齡鼠I

10、RI后0d雙腎即可見大量的SA-β-Gal染色陽性腎小管上皮細(xì)胞、且顯著重于p21(-/-)鼠(P<0.05)，但1d后，p21(+/+)和p21(-/-)鼠IRI腎衰老細(xì)胞明顯減少(P<0.05)，1月后又呈進行性增加，且p21(+/+)始終比p21(-/-)鼠嚴(yán)重。高齡和低齡p21(+/+)鼠PCNA陽性染色細(xì)胞出現(xiàn)的幾率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但低齡鼠細(xì)胞增殖能力要強于高齡鼠；而p21(-/-)鼠的細(xì)胞增殖能力明顯強于p

11、21(+/+)鼠、低齡鼠更為顯著(P<0.05)。對高齡鼠IRI后1d點細(xì)胞衰老和凋亡進行相關(guān)分析顯示，二者呈顯著負(fù)相關(guān)[p21(+/+)鼠r=-0.82，P<0.001；p21(-/-)鼠r=-0.76，P<0.001]。 4．結(jié)論：p21在IRI所致腎小管上皮細(xì)胞演變過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。 第三部分．P53對缺血再灌注損傷后腎小管上皮細(xì)胞演變的影響 1．目的：觀察缺血再灌注損傷(IRI)后，低齡和高

12、齡p53(+/+)和p53(-/-)鼠腎小管上皮細(xì)胞的演變，探討P53基因?qū)RI后腎小管上皮細(xì)胞演變的影響。 2．方法：分別建立低齡(2月齡)和高齡(12月齡)p53(+/+)和：P53(-/-)鼠左腎IRI模型。于IRI后0d、1d、3d、7d、1月、3月、6月，用HE染色觀察腎小管組織學(xué)變化，免疫熒光法檢測。腎小管上皮細(xì)胞增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)的表達

13、，組織化學(xué)染色觀察腎小管上皮細(xì)胞衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶(sA-β-gal)的活性，用脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記(terminal deoxynucleotidyltransferase-mediated dUTP-biotin in situ nick-end labeling，TUNEL)法檢測腎小管上皮細(xì)胞凋亡。 3．結(jié)果：IRI后0d，腎小管以壞死為主，高齡鼠比低齡鼠明顯(P<0.05)，p53(-/-)鼠比p

14、53(+/+)鼠明顯(P<0.05)；細(xì)胞凋亡在7d時達到高峰，且高齡鼠比低齡鼠明顯(P<0.05)，p53(+/+)鼠比p53(-/-)鼠明顯(P<0.05)。p53(+/+)低齡鼠IRI后1月出現(xiàn)衰老細(xì)胞，3月和6月顯著增多(P<0.05)，對側(cè)腎未見衰老細(xì)胞；而p53(-/-)低齡鼠IRI后6月才出現(xiàn)明顯的衰老細(xì)胞；兩種基因型高齡鼠在IRI后0d雙腎均見衰老細(xì)胞，但p53(+/+)鼠顯著多于p53(-/-)鼠(P<0.05)，1d

15、后，IRI腎的衰老細(xì)胞明顯減少(P<0.05)，對側(cè)腎無變化。p53(+/+)高齡和低齡鼠細(xì)胞增殖沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而p53(-/-)低齡和高齡鼠在IRI后3、7d細(xì)胞增殖進行性增加，且低齡鼠顯著多于高齡鼠、p53(-/-)鼠多于p53(+/+)鼠(P<0.05)。對高齡鼠IRI后1d點細(xì)胞衰老和凋亡進行相關(guān)分析顯示，在p53(+/+)鼠二者顯著負(fù)相關(guān)(r=0.82，P<0.05)，在p53(-/-)鼠，二者無顯著相關(guān)性(

16、r=0.26，P>0.05)。 4．結(jié)論：p53在IRI所致腎小管上皮細(xì)胞演變過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。 第四部分p53-p21-Rb信號通路在缺血再灌注損傷誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞衰老中的作用 1．目的：研究腎臟缺血再灌注損傷(IRI)后期腎小管上皮細(xì)胞的衰老演變以及p53、p21和Rb表達的變化，探討p53-Rb信號通路在腎小管上皮細(xì)胞衰老中的作用。 2．方法：建立p53(+/+)和p53(-/-)鼠單側(cè)

17、腎臟缺血再灌注損傷(IRI)模型，研究IRI后不同時間點腎小管組織形態(tài)學(xué)變化、腎小管上皮細(xì)胞的衰老變化以及p52、p21和Rb蛋白表達的變化。 3．結(jié)果：p53(+/+)鼠腎臟在IRI后期，出現(xiàn)嚴(yán)重而廣泛的慢性小管間質(zhì)纖維化，腎小管上皮細(xì)胞衰老在IRI后3月和6月點顯著增加(P<0.05)；而在p53(+/+)鼠對側(cè)腎和p53(-/-)鼠雙腎，在IRI后1月和3月點幾乎沒有出現(xiàn)腎小管上皮細(xì)胞衰老；p53(-/-)鼠的IRI腎在I