Leber遺傳性視神經(jīng)病變家系的臨床和分子遺傳學研究.pdf

1、第一部分Leber遺傳性視神經(jīng)病變患者篩查及資料收集第二部分Leber遺傳性視神經(jīng)病變T14484C突變家系分子機制研究 目的：1.在全國各地收集視神經(jīng)病變家系,建立臨床資料和分子遺傳學資料數(shù)據(jù)庫. 2.對收集到的家系三個原發(fā)位點(G3460A、Gll778A、T14484C)進行檢測是否在中國人群中存在及統(tǒng)計突變發(fā)病頻譜. 3.對其中T14484C家系進行線粒體基因組全序列測序,分析繼發(fā)位點和其它影響功能的突

2、變位點對T14484C家系的外顯率和發(fā)病嚴重程度的影響. 4.了解T14484C突變在中國人群中的臨床表現(xiàn)、外顯率、發(fā)病年齡、男女發(fā)病比例;分析其它因素(如核基因、環(huán)境因素、單倍型和生理心理因素等)對外顯率和發(fā)病嚴重程度的影響. 方法：1.通過溫州醫(yī)學院眼視光醫(yī)院與北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院眼科和福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院合作,建立起視神經(jīng)病變家系收集網(wǎng)絡,另外還有全國各地醫(yī)院和科研院所送來的少量家系資料.經(jīng)溫州醫(yī)學院倫理道德

3、委員會及辛辛那提兒童醫(yī)院醫(yī)學中心委員會許可,病人及所有受試者同意,簽署知情同意書,采集血樣,了解家系情況,并建好數(shù)據(jù)庫. 2.對該家族中的所有成員進行眼科臨床檢查,包括標準對數(shù)視力表檢測視力,俞自萍色覺圖檢查,Humphrey視野計按程序SITA檢查(Humphrey Visual Field AnalyzerIIi,SITAStandard),德國羅蘭電生理儀(Roland Consult RETI port gamma,pa

4、ttern or flash VEP)檢查視覺誘發(fā)電位(VEP)以及佳能眼底數(shù)碼彩照(Canon CR6-45NM fundus camera)拍攝眼底. 3.對采集的血樣提取基因組DNA,并設計包含三個原發(fā)位點的三對引物進行PCR擴增、純化和測序. 4.對其中檢測出的T14484C家系設計出擴增線粒體基因組全序列的24對引物,然后進行PCR擴增、純化并測序. 5.使用各種生物軟件分析測序結(jié)果,找出所有的多態(tài)性位

5、點和突變位點,分析其對功能的影響. 6.對收集的臨床資料進行整理,分析其與各個突變位點之間的關聯(lián)性. 結(jié)果：1.我們共收集了345個視神經(jīng)病變的家系,其中檢測出LHON三個原發(fā)位點(G11778A、G3460、T14484C)的家系共129個,在患者中沒有發(fā)現(xiàn)三個原發(fā)位點同時出現(xiàn)兩個或三個突變位點的情況.其中發(fā)生T14484C突變的家系有15個,占三個原發(fā)位點發(fā)病率的11.6﹪(15/129).而其它位點(G3316A、

6、C3394T、T3497C)家系21個,G11696A突變家系14個,G11696A和G11778A雙位點突變家系3個,另外也發(fā)現(xiàn)了影響功能突變位點(A4435G、A15951G、A10059G)的家系各1個. 2.對其中6個T14484C突變家系研究,發(fā)現(xiàn)患者發(fā)病年齡從6歲到26歲不等,平均18.9歲;視力損害程度從正常到重度不等,多為中度到重度;各個家系男女發(fā)病比分別為3:0、1:0、1:0、3:0、2:0、1:1,而男女發(fā)

7、病比為11:;各個家系外顯率分別為18.8﹪、5.9﹪、16.7﹪、23.1﹪、22.2﹪、15.4﹪,平均為16.2﹪. 3.通過對以上6個Leber遺傳性視神經(jīng)病變T14484C突變的家系線粒體基因組全序列進行測序后分析,除了T14484C突變外,這些家系先證者線粒體DNA呈現(xiàn)一種獨特的多態(tài)性:在D-loop區(qū)總共有36個變異位點,都已經(jīng)被報道過;而在13個多肽編碼區(qū)存在著更多的變異位點,共有65個,其中25個還沒有被報道過

8、,但大多數(shù)為同義突變,共有30個,而錯義突變位點有25個,未曾報道過的錯義突變位點有11個,分布于13個多肽編碼區(qū)上;在12S rRNA基因區(qū)存在3個已報道的多態(tài)位點,在16S rRNA基因區(qū)也存在3個多態(tài)位點,其中1719InsG未見報道;另外在為22個tRNA基因編碼區(qū)也存在多態(tài)性位點共2個:tRNA<'Cys>G5821A和tRNA<'Gly>T10031C.另外在家系WZ147中存在一個與LHON有關的其它突變位點(G3316A

9、).對其它RNA基因區(qū)的變異位點和編碼區(qū)因突變發(fā)生改變的氨基酸在人、牛、鼠、蟾蜍中進行比對,發(fā)現(xiàn)它們在進化上并不保守. 4.線粒體DNA單體型的分析發(fā)現(xiàn)這6個家系的mtDNA分別屬于R11、D4、C、C4、C、M8a,說明他們不是來自于一個中國祖先,發(fā)病呈散發(fā)現(xiàn)象. 結(jié)論：1.在中國人群中存在T14484C突變,并可使攜帶者致病,但并不是每個攜帶者都發(fā)病,發(fā)病外顯率為16.2﹪,與G11778A相比明顯為低.在160個中

10、國正常人群中沒有發(fā)現(xiàn)T14484C突變的存在. 2.T14484C在中國人3個原發(fā)位點突變中的發(fā)病頻譜為11.6﹪. 3.在6個T14484C突變家系中發(fā)病男性明顯多于女性,男女比例為11:1,多發(fā)生在青年人身上. 4.在研究的6個T14484C突變家系中,他們的線粒體單倍型分別屬于Rll、D4、C、C4、C、M8a,并沒有找到這些單位型與外顯率和發(fā)病嚴重程度之間的聯(lián)系. 5.這些家系先證者和家系成員發(fā)病

11、,多數(shù)視力都有所恢復,有的甚至不經(jīng)過治療也能恢復到正常視力,恢復率大約為75﹪,高于國外報道. 6.母系成員盡管攜帶有相同的mtDNA,但表現(xiàn)出不同的病情、發(fā)病年齡及愈后,雖然還沒有定論,但目前大多數(shù)學者認為LHON的外顯率和表現(xiàn)度與核修飾基因、環(huán)境因素及單體型有關,有待更進一步的深入研究. 第三部分Leber遺傳性視神經(jīng)病變G11696A突變家系分子機制研究 目的：1.對其中G11696A的家系進行線粒體基因組

12、全序列測序,分析繼發(fā)位點和其它影響功能的突變位點對G11696A家系的外顯率和發(fā)病嚴重程度的影響.2.了解G11696A突變在中國人群中的臨床表現(xiàn)、外顯率、發(fā)病年齡、男女發(fā)病比例:分析其它因素(如核基因、環(huán)境因素、單倍型等)對外顯率和發(fā)病嚴重程度的影響. 方法：1.對其中檢測出的兩個G11696A突變家系設計出擴增線粒體基因組全序列的24對引物,然后進行PCR擴增、純化并測序.2.使用各種生物軟件分析測序結(jié)果,找出所有的多態(tài)性位

13、點和突變位點,分析其對功能的影響.3.對收集的臨床資料進行整理,分析其與突變位點之間的關聯(lián). 結(jié)果：1.這兩個G11696A突變家系患者發(fā)病年齡分別為10歲和17歲,平均13.5歲;視力損害程度多為輕度到中度;各個家系外顯率分別為10.0﹪、9.1﹪,平均為9.5﹪.2.在先證者及家系成員未能檢測到最常見的三個原發(fā)mtDNA突變位點(G3460A、G11778A、T14484C),但在兩個先證者及其家系母系成員中均發(fā)現(xiàn)ND4.G

14、11696A突變位點,并導致ND4亞基312位的纈氨酸變成異亮氨酸.167名中國正常對照分析發(fā)現(xiàn)只有一例是陽性(男,25歲).這兩個家系存在許多的多態(tài)性位點:D-100p區(qū)有10個,rRNA有5個,在多肽編碼區(qū)存在25個突變位點:其中14個為無義突變,11個為錯義突變;WZ21-Ⅲ-3還存在3個新的變異ND2亞基T4500C(S11P),ATPase 6亞基C8702T(T59I)和ND4L亞基T10663C(V65A).通過對牛、小鼠

15、、蟾蜍及人幾個不同物種保守性分析,這些發(fā)生變異的位點和氨基酸在進化上并不保守.3.線粒體DNA單體型的分析發(fā)現(xiàn)這兩個家系的mtDNA屬于D4,沒有發(fā)現(xiàn)有其它影響功能位點的存在. 結(jié)論：1.在中國人群中存在G11696A突變,并可使攜帶者發(fā)病,但并不是每個攜帶者都發(fā)病.在167個正常對照中發(fā)現(xiàn)一例G11696A突變,說明G11696A突變不是致病的唯一因素. 2.這兩個G11696A家系都只有一名男性發(fā)病,發(fā)病年齡平均13

16、.5歲,平均外顯率極低,約為9.5﹪,遠低于原發(fā)位點G11778A、T14484C的外顯率. 3.在研究的兩個家系中,他們的線粒體單倍型都屬于D4,可能來自一個共同的祖先,并沒有找到這個單位型D4.與外顯率和發(fā)病嚴重程度之間的關聯(lián). 4.不完全外顯率、臨床表現(xiàn)和在正常對照出現(xiàn)(1/167)表明G11696A突變本身不足以導致LHON的發(fā)生,可能其它因素在這兩個LHON家系的表型表達中也起一定的作用.在這些家系mtDNA中