單基因遺傳病新致病基因的鑒定及其致病機制探索.pdf

1、目的：單基因遺傳病又稱為孟德爾遺傳病，目前已報道的單基因遺傳?。ū硇停┘s有6000多種，已明確致病基因的約有4000多種，但還有2000多種疾病的致病基因未知。全外顯子組測序（Whole exome sequencing，WES）是指利用序列捕獲技術(shù)將全基因組外顯子區(qū)域DNA捕捉后進行高通量測序的基因組分析方法，是目前鑒定單基因遺傳病致病基因最重要的研究方法。本研究旨在基于WES技術(shù)發(fā)掘和鑒定新致病基因，并進行相關(guān)的致病機制研究。

2、>　　方法：1.建立包括外顯子文庫建立、上機測序、數(shù)據(jù)分析和變異解釋驗證在內(nèi)的完整WES方法，即利用Agilent SureSelect方法外顯子捕獲，Illumina測序平臺進行高通量測序，測序數(shù)據(jù)經(jīng)NextGENe軟件匹配分析后，用Ingenuity在線軟件系統(tǒng)進行變異篩選確認及解釋。2.收集16個不同表型特征的單基因遺傳病家系為研究對象，選擇家系成員（共計24例患者）的DNA樣本做WES檢測。評估測序數(shù)據(jù)的覆蓋度、深度和均一性等，

3、生物信息學分析方法分析鑒定候選致病基因，用Sanger測序法在家系成員中驗證并鑒定新致病基因。3.構(gòu)建候選基因的野生型和突變型表達質(zhì)粒，比較在HEK293T細胞中GDF6蛋白的表達。
　　結(jié)果：1.使用Agilent Sureselect V4試劑盒制備WES文庫，99％以上的目標區(qū)域可以被成功捕獲，70%以上的Reads位于靶序列以內(nèi)。當平均測序深度達到100X時，20X以上覆蓋區(qū)域>92%，且均一性較為一致。采用Illumin

4、a Hiseq2000和Miseq測序平臺，Reads與人類基因組參考序列匹配度>99%。每個樣本約有18,000多個SNVs位于編碼區(qū)，其中約60%的變異為同義變異，40%為錯義變異，約有60~80個變異為無義突變、200個為Indels。2.測序數(shù)據(jù)通過Ingenuity Variant Analysis軟件分析、Sanger測序驗證后，16個單基因遺傳病家系中的8個家系鑒定到了致病基因，包括GDF6、GLI3、EXT2、GORAB

5、、COL4A5、IDS、COMP和PTHLH基因。3.在多發(fā)性骨性連接綜合征（mμltiple synostoses syndrome,SYNS）家系中鑒定到GDF6基因雜合錯義突變p.Y444N，該突變與家系成員骨融合表征完全共分離，確認GDF6基因為SYNS新致病基因。4.在轉(zhuǎn)染的293T細胞培養(yǎng)液上清中，GDF6成熟蛋白（mature-GDF6）的含量，突變型（p.Y444N）與野生型相比明顯降低。
　　結(jié)論：1.本研究建立