缺氧預處理對大鼠神經(jīng)干細胞內(nèi)源性保護作用的體外實驗研究.pdf

1、目的：探討不同時間缺氧處理對體外培養(yǎng)大鼠神經(jīng)干細胞(NSCs)的影響；缺氧預處理對大鼠神經(jīng)干細胞再次經(jīng)受致死性缺氧的內(nèi)源性保護作用以及促紅細胞生成素(EPO)在保護機制中的作用。 方法：取孕13天的SD胎鼠腦組織，懸浮法培養(yǎng)神經(jīng)干細胞，免疫組織化學方法鑒定細胞性質(zhì)及分化潛能情況。施加1～12小時不同時間缺氧培養(yǎng)，觀察其對NSCs生長、分化的影響，以 MTT 法測定缺氧對細胞活性的影響，并以western blot法檢測缺氧4小時

2、后 EPO 蛋白的表達。以4小時為缺氧預處理條件，12小時為致死劑量缺氧處理條件，分別在缺氧預處理4h、8h、12h、24h、36h、48h、60h，再次給予致死劑量缺氧處理，檢測細胞存活率以觀察預處理對NSCs的保護作用，以同時加入EPO中和抗體、非特異性IgG以及未經(jīng)預處理的神經(jīng)干細胞作對照組。根據(jù)預處理與致死劑量缺氧的時間間隔分為兩組：4小時組、24小時組，測定細胞致死缺氧后即刻、4小時的 EPO 表達情況。 結果：懸浮

3、法培養(yǎng)所獲細胞的 nestin 鑒定為陽性，同時具有神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞等多分化潛能。缺氧時間不超過4小時，對NSCs大體形態(tài)、進一步培養(yǎng)、分化無明顯影響，缺氧后細胞存活率無顯著變化；缺氧時間為8、12小時，可顯著降低培養(yǎng)后的細胞活性。經(jīng)過缺氧預處理的NSCs，在處理后12～48小時間，對再次經(jīng)歷的致死性缺氧有明顯耐受作用，與對照組相比較，其細胞存活率顯著提高。這種保護作用可以被EPO中和抗體所阻斷，而非特異性IgG無效。

4、缺氧預處理后的EPO蛋白即刻表達，4小時達到頂峰，可維持至8小時。預處理與致死缺氧間隔為4、24小時的兩組細胞再次缺氧后即刻的EPO蛋白表達無顯著差異，4小時后，24小時組細胞的EPO表達量明顯高于4小時組。 結論：4小時的缺氧處理對體外培養(yǎng)的大鼠NSCs較為安全，其形態(tài)、增殖、分化以及細胞存活率無特殊變化，可以作為預處理條件；缺氧預處理可以使NSCs對一定時間內(nèi)的再次致死缺氧具有耐受保護作用；這種保護作用可能與缺氧后NSCs