VEGF-C對胰腺癌淋巴結轉移的作用機制及其與預后相關性的研究.pdf

1、胰腺癌是預后最為惡劣的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，90[％]的患者就診時已屬進展期，治療手段單一，手術切除率低，5年生存率不超過5[％]。而胰腺癌早期即可發(fā)生區(qū)域淋巴結轉移，是影響患者預后的重要因素。因此，對胰腺癌淋巴結轉移機制及干預手段的深入研究具有重要的意義。
　　 VEGF-C基因是1996年被克隆定位于人染色體4q34上的一個新基因。近年來的大量研究結果顯示，其與腫瘤淋巴結轉移高度特異性相關。目前認為，VEGF-C通過結合淋巴

2、管內皮細胞上表達的受體VEGFR-3促進腫瘤“淋巴管生成”是腫瘤淋巴結轉移的關鍵機制之一。但實驗研究證實，沉默VEGFR-3的表達以抑制腫瘤“淋巴管生成”對已轉移至淋巴結的腫瘤細胞并無抑制作用。因此，對就診時多已發(fā)生淋巴結轉移的胰腺癌患者來說，抑制腫瘤“淋巴管生成”的效果可能并不樂觀。
　　 最近，有研究結果提示腫瘤細胞VEGF-C的異常表達與腫瘤細胞寄生部位的局部微環(huán)境關系密切。進一步通過免疫組織化學染色的方法，在乳腺癌原位種

3、植瘤模型中發(fā)現(xiàn)存在部分轉移至淋巴管內的乳腺癌細胞VEGF-C陽性表達增多的情況；而對人胰腺癌標本中也發(fā)現(xiàn)，轉移至淋巴結的胰腺癌細胞VEGF-C染色陽性率明顯高于原發(fā)灶的有趣現(xiàn)象。
　　 那么，在淋巴結轉移灶局部微環(huán)境的影響下，胰腺癌細胞VEGF-C表達是否存在器官差異性呢？如果存在，這種差異性對胰腺癌細胞淋巴結轉移又發(fā)揮何種作用，能否為我們提供一個抑制胰腺癌細胞淋巴結轉移的新思路呢？通過對VEGF-C在胰腺癌淋巴結轉移中作用的進

4、一步認識，其能否成為判斷胰腺癌預后的一種輔助指標呢？
　　 為此，我們進行了以下三個部分的研究。
　　 第一部分、VEGF-C在胰腺癌細胞種植瘤模型原位灶與淋巴結轉移灶中表達的差異性
　　 目的：
　　 研究胰腺癌PANC-1細胞在原位種植瘤模型原位灶與淋巴結轉移灶中VEGF-C表達的差異性。
　　 方法：
　　 建立胰腺癌PANC-1細胞原位種植瘤模型，原代分離培養(yǎng)原位灶與淋巴結轉移灶中

5、腫瘤細胞，通過RT-PCR、Western Blot、ELISA等方法檢測其VEGF-C的表達情況。
　　 結果：
　　 胰腺癌PANC-1細胞原位種植瘤模型成瘤率100.0[％]，自發(fā)性淋巴結轉移發(fā)生率為62.5[％]，自發(fā)性肝轉移發(fā)生率為25.0[％]，未見肺轉移。
　　 將原代分離培養(yǎng)的原位灶與淋巴結轉移灶中胰腺癌細胞分別命名為PANC-1-PRO和PANC-1-LN細胞。兩細胞中VEGF-C基因mRNA表

6、達水平分別為0.61±0.15與0.87±0.11，細胞中的VEGF-C蛋白表達水平分別為0.65±0.17與0.88±0.09，細胞培養(yǎng)液上清液中VEGF-C蛋白表達含量分別為(1403.67±128.15)pg/ml與(1682.37±156.73)pg/ml，PANC-1-LN細胞VEGF-C的表達水平均明顯高于PANC-1-PRO細胞，差異有統(tǒng)計學意義(t=3.1255、2.9062、3.0782，P=0.0141、0.0197

7、、0.0152)。
　　 結論：
　　 原位種植瘤模型自發(fā)性淋巴結轉移灶中胰腺癌PANC-1細胞的VEGF-C表達水平顯著高于原位灶中腫瘤細胞，胰腺癌細胞的VEGF-C表達存在器官差異性。
　　 第二部分、VEGF-C特異性反義寡核苷酸對淋巴結轉移灶胰腺癌細胞凋亡的影響
　　 目的：
　　 研究VEGF-C特異性反義寡核苷酸對原位灶與淋巴結轉移灶中胰腺癌細胞凋亡的影響。
　　 方法：

8、>　　 建立胰腺癌PANC-1細胞原位種植瘤模型，原代分離培養(yǎng)原位灶與淋巴結轉移灶中腫瘤細胞(PANC-1-PRO和PANC-1-LN細胞)，分為空白對照、錯義寡核苷酸、反義寡核苷酸3個處理組。應用RT-PCR、Western Blot、ELISA、流式細胞術、TUNEL等方法檢測VEGF-C反義寡核苷酸的體內外轉染對其表達水平以及對胰腺癌細胞凋亡的影響。
　　 結果：
　　 體外轉染后，反義組PANC-1-PRO和P

9、ANC-1-LN細胞中VEGF-C的mRNA、蛋白表達水平及細胞培養(yǎng)液上清液中蛋白表達含量均較空白、錯義組顯著降低(P＜0.01)。而3組PANC-1-PRO和PANC-1-LN細胞中凋亡相關基因bcl-2的mRNA表達水平分別為0.67±0.12、0.69±0.14、0.61±0.11和0.56±0.16、0.59±0.18、0.27±0.17，僅PANC-1-LN細胞的反義組bcl-2表達水平較前2組明顯下調(t=3.0428、3.

10、1659，P=0.0124、0.0101)。PANC-1-PRO細胞轉染后，3組的早期細胞凋亡率分別為(3.51±1.38)[％]、(4.79±2.16)[％]、(5.33±2.18)[％]，差異無統(tǒng)計學意義(t=1.7279、0.4310，P=0.1147、0.6756)；而PANC-1-LN細胞3組早期細胞凋亡率分別為(2.83±1.01)[％]、(4.98±2.05)[％]、(13.22±2.17)[％]，反義組細胞凋亡率顯著上升

11、，差異有顯著統(tǒng)計學意義(t=10.6329、6.7613，P=0.0000、0.0000)。
　　 體內轉染后，反義組種植瘤模型血清中VEGF-C蛋白含量較空白、錯義組顯著降低(P＜0.05)。3組模型瘤體體積、淋巴結轉移發(fā)生率及轉移淋巴結數(shù)的差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。3組原位灶胰腺癌細胞凋亡率分別為(1.29±0.53)[％]、(1.98±0.77)[％]、(2.01±0.80)[％]，組間差異均無統(tǒng)計學意義(t=2

12、.1221、0.0764，P=0.0522、0.9402)；而3組淋巴結轉移灶胰腺癌細胞平均凋亡率分別為(1.78±0.49)[％]、(1.96±0.68)[％]、(4.38±1.02)[％]，反義組細胞凋亡率顯著上升，差異有顯著統(tǒng)計學意義(t=6.4987、5.2301，P=0.0000、0.0001)。
　　 結論：
　　 抑制淋巴結轉移灶中胰腺癌細胞VEGF-C的表達可促進淋巴結轉移灶中胰腺癌細胞的凋亡，和bcl-

13、2表達下調有關；但對原發(fā)灶胰腺癌細胞無明顯影響。VEGF-C基因的作用機制也存在器官差異性，是胰腺癌淋巴結轉移的機制之一。
　　 第三部分、無法切除胰腺癌患者血清VEGF-C蛋白含量與預后相關性的研究
　　 目的：
　　 研究無法切除胰腺癌患者血清中VEGF-C蛋白含量與預后的關系。
　　 方法：
　　 選擇華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院胰腺外科中心2004年12月～2005年8月間無法切除的

14、局部晚期胰腺癌病例35例，記錄入組時的KPS評分、CT資料的腫瘤最大直徑及血清CA19-9值等相關指標。ELISA檢測患者血清中VEGF-C蛋白含量，并選擇10例健康者血清作為對照。應用Kaplan-Meier法計算生存率，并繪制生存曲線，Log-rank法檢驗不同變量間生存率的差異，Cox回歸模型進行預后的單因素分析和多因素分析。
　　 結果：
　　 35例胰腺癌患者血清中VEGF-C蛋白含量平均值為(1309.23±

15、542.05)pg/ml，10例對照者為(256.13±96.59)pg/ml，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 將35例胰腺癌患者的年齡、腫瘤最大直徑、腫瘤生長部位、KPS評分、血清CA19-9值及VEGF-C值等指標一起納入Cox風險模型，進行預后單因素分析，發(fā)現(xiàn)KPS評分、血清CA19-9值及VEGF-C值均入選為無法切除的晚期胰腺癌患者預后影響因素(χ2=7.208、6.908、3.867，P=0.007、0.0

16、29、0.049)。
　　 對上述篩選變量進行多因素Cox回歸模型分析，引入標準為0.10、刪除標準為0.11，采用后退法，發(fā)現(xiàn)最先退出模型的是CA19-9值(χ2=3.738，P=0.053)，然后是VEGF-C(χ2=4.873，P=0.027)，最后是KPS評分(χ2=5.274，P=0.022)，。
　　 比較KPS評分＜70分與≥70分的兩組病例預后，結果顯示2組平均生存時間分別為6.60月與10.11月，1年

17、累積生存率分別為21.43[％]與33.33[％]；取胰腺癌患者血清中VEGF-C蛋白含量中位數(shù)1280pg/ml為分界點，比較血清VEGF-C值≤1280pg/ml與＞1280pg/ml的兩組病例預后，結果顯示2組平均生存時間分別為11.26月與6.29月，1年累積生存率分別為50.00[％]與5.88[％]；KPS評分及血清VEGF-C值的組間差異均有統(tǒng)計學意義(χ2=4.0400、9.4000，P=0.0443、0.0022)。而

18、血清CA19-9值≤200U /ml與＞200U/ml的兩組病例，平均生存時間分別為9.99月與7.76月，1年累積生存率分別為37.50[％]與21.05[％]，差異無統(tǒng)計學意義(χ2=1.9100，P=0.1667)。
　　 結論：
　　 無法切除的局部晚期胰腺癌患者，其KPS評分和預后顯著相關，可作為預后的獨立影響因素；而血清中VEGF-C蛋白含量值與CA19-9值均和預后存在一定關系，可作為預后判斷的輔助參考指標