下調(diào)端粒酶活性對(duì)乳腺癌生物學(xué)特性影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、乳腺癌是嚴(yán)重危害女性健康的常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，中國(guó)女性乳腺癌的發(fā)病率與世界多數(shù)發(fā)達(dá)國(guó)家相比雖然較低，但從20世紀(jì)末到21世紀(jì)初的短短20年里，該病發(fā)病率已急速上升，而且發(fā)病年齡也逐漸年輕化，使得這一疾病的危害更加顯著。半個(gè)世紀(jì)以來(lái)，傳統(tǒng)的乳腺癌治療發(fā)生了劃時(shí)代的變化，由單純手術(shù)治療轉(zhuǎn)變?yōu)橐酝饪剖中g(shù)為主，聯(lián)合放療、化療、內(nèi)分泌治療等的綜合治療。盡管人們對(duì)乳腺癌的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移的機(jī)理等生物學(xué)特性方面做了深入的研究，取得了較大的進(jìn)步，但是，

2、乳腺癌患者的死亡率仍徘徊在20/10萬(wàn)左右。研究其侵襲及轉(zhuǎn)移的機(jī)理等生物學(xué)特性，以及利用分子生物學(xué)技術(shù)，阻斷腫瘤細(xì)胞侵襲、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的靶點(diǎn)，已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)之一。
　　 RNA干涉(RNAi)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的在生物體內(nèi)普遍存在的一種古老的生物學(xué)現(xiàn)象，它是由dsRNA介導(dǎo)的、Dicer酶參與的特異性基因沉默現(xiàn)象，可以在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平及翻譯水平上特異性阻斷目的基因的表達(dá)。端粒酶(telomerase)是由一個(gè)互補(bǔ)于端粒DNA

3、的RNA亞基和具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的端粒酶催化亞基(TERT)及相關(guān)蛋白組成。端粒酶活性的表達(dá)與細(xì)胞衰老和某些疾病，特別是腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。TERT被普遍認(rèn)為是端粒酶的催化亞基，其基因的表達(dá)與端粒酶的激活密切相關(guān)。端粒酶特異性高表達(dá)于包括乳腺癌在內(nèi)的絕大部分惡性腫瘤，而絕大多數(shù)正常組織幾乎不表達(dá)的特性使之成為腫瘤治療的優(yōu)選靶點(diǎn)。通過(guò)特異性下調(diào)TERT基因表達(dá)改變腫瘤細(xì)胞端粒酶活性，伴隨端粒酶活性改變，腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)

4、特性隨之改變。
　　 端粒酶在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)如何？端粒酶活性與乳腺癌細(xì)胞增殖、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)特性關(guān)系如何？下調(diào)端粒酶活性對(duì)乳腺癌上述生物學(xué)活性的影響如何？為回答上述相關(guān)問(wèn)題，本研究擬利用RNAi技術(shù)，設(shè)計(jì)針對(duì)hTERT基因mRNA特異性短發(fā)夾干擾片段，利用分子克隆技術(shù)，重組pSUPER_retro_puro質(zhì)粒，經(jīng)鑒定正確后轉(zhuǎn)染乳腺癌MCF-7、MDA-MB231細(xì)胞系，建立端粒酶活性下調(diào)的乳腺癌細(xì)胞系，檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞

5、端粒酶活性變化，通過(guò)MTT法、軟瓊脂集落形成形成實(shí)驗(yàn)等對(duì)細(xì)胞增殖；劃痕實(shí)驗(yàn)對(duì)細(xì)胞遷移；Transwell實(shí)驗(yàn)對(duì)細(xì)胞侵襲能力；以及轉(zhuǎn)染后細(xì)胞對(duì)電離輻射、化療藥物作用的敏感性等進(jìn)行研究，探討下調(diào)端粒酶活性對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及對(duì)放化療敏感性的影響，初步探討端粒酶為靶點(diǎn)的乳腺癌基因治療結(jié)合傳統(tǒng)腫瘤治療方法的效應(yīng)等相關(guān)問(wèn)題。
　　 材料和方法:
　　 1、靶向hTERT基因mRNA的shRNA質(zhì)粒表達(dá)載體的構(gòu)建
　

6、　 設(shè)計(jì)并采用化學(xué)合成法合成靶向hTERT基因mRNA序列的短發(fā)夾寡核苷酸序列，經(jīng)退火后連接到線(xiàn)性化pSUPER_retro_puro質(zhì)粒BgIII和HND III酶切位點(diǎn)之間，構(gòu)建hTERT shRNA表達(dá)質(zhì)粒載體pSUPER_retro_puro-TERT-RNAi＃1、＃2(pSUPER-TERT-RNAi＃1、＃2)，經(jīng)EcoRI和HINDIII雙酶切電泳分析及插入基因片段序列分析，驗(yàn)證插入目的基因片段位置及序列正確性。

7、>　　 2、穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系建立和轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞端粒酶活性及hTERT基因mRNA水平和蛋白水平變化
　　 采用磷酸鈣法將擴(kuò)增純化后的pSUPER-TERT-RNAi＃1、＃2重組質(zhì)粒(轉(zhuǎn)染組)及pSUPER_retro_puro質(zhì)粒(陰性對(duì)照組)分別轉(zhuǎn)染MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞系，經(jīng)puromycin藥物篩選，建立穩(wěn)定表達(dá)的陽(yáng)性細(xì)胞克隆。采用Trizol法收集細(xì)胞總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，設(shè)計(jì)hTERT mRN

8、A引物，選取GAPDH為內(nèi)參對(duì)照，RT-PCR檢測(cè)mRNA水平；收集各組細(xì)胞總蛋白，選取α-tubulin為內(nèi)參對(duì)照，Western blotting檢測(cè)各組細(xì)胞端粒酶蛋白表達(dá)，TRAP-ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞端粒酶活性，與陰性對(duì)照組及未經(jīng)處理的MCF-7和MDA-MB231細(xì)胞系(空白對(duì)照組)比較各組間差異。
　　 3、端粒酶活性下調(diào)對(duì)乳腺癌細(xì)胞系增殖、遷移及侵襲能力的影響
　　 采用MTT法、瓊脂糖凝膠克隆形成檢測(cè)轉(zhuǎn)

9、染前后乳腺癌細(xì)胞增殖活性，劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后乳腺癌細(xì)胞遷移能力，同時(shí)利用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后乳腺癌細(xì)胞的侵襲能力等的變化，評(píng)價(jià)端粒酶活性下調(diào)后對(duì)乳腺癌細(xì)胞系增殖、遷移及侵襲能力的影響。
　　 4、端粒酶活性下調(diào)對(duì)乳腺癌細(xì)胞電離輻射、化療藥物敏感性的影響
　　 選取常用化療藥物阿霉素經(jīng)稀釋后加入各組細(xì)胞培養(yǎng)液中或利用UV-crosslink對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行UV照射，經(jīng)一定時(shí)間培養(yǎng)后，利用MTT法對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)各

10、組細(xì)胞增殖活性進(jìn)行檢測(cè)，探討端粒酶活性下調(diào)對(duì)乳腺癌細(xì)胞放療、化療敏感性的影響。
　　 5、數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理分析
　　 細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)采用圖片說(shuō)明，各組間差異通過(guò)軟件進(jìn)行量化后應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)量化數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，判別各組間差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　 1、靶向hTERT基因mRNA的shRNA質(zhì)粒表達(dá)載體的構(gòu)建
　　 重組構(gòu)建pSUPER- TERT-RNAi＃1、＃2經(jīng)E

11、coRI和HINDIH雙酶切電泳分析顯示目的片段成功插入正確位置；選取酶切正確重組質(zhì)?？寺∷托蛄袡z測(cè)分析結(jié)果表明合成序列成功插入預(yù)定位點(diǎn)，且序列與設(shè)計(jì)合成的完全一致。說(shuō)明成功構(gòu)建hTERT shRNA表達(dá)質(zhì)粒載體。
　　 2、穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系建立和轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞端粒酶活性及hTERT基因mRNA水平和蛋白水平變化
　　 轉(zhuǎn)染組和陰性對(duì)照組細(xì)胞經(jīng)puromycin藥物篩選兩周后，成功構(gòu)建陽(yáng)性克隆。與空白對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染組端粒酶

12、活性下調(diào)明顯，其中MCF-7細(xì)胞系RNAi＃1下調(diào)至50.88±13.41％，RNAi＃2組下調(diào)至35.45±6.20％，MDA-MB231細(xì)胞系RNAi＃1下調(diào)至49.47±7.1％，RNAi＃2組下調(diào)至42.40±8.37％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，陰性對(duì)照組端粒酶活性無(wú)明顯變化；與空白對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞hTERT基因mRNA水平明顯下降，其中MCF-7細(xì)胞系RNAi＃1相對(duì)積分光密度為54.89±1.06％，RN Ai＃2組為49.

13、90±4.98％，空白對(duì)照組為99.18±6.62％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，陰性對(duì)照組為98.19±2.84％，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。MDA-MB231細(xì)胞系RNAi＃l組相對(duì)積分光密度為56.64±10.79％，RNAi＃2組為50.00±3.16％，空白對(duì)照組為101.85±4.34％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，陰性對(duì)照組為102.22±2.47％；空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 3、下調(diào)端粒酶活性對(duì)乳腺癌細(xì)胞系增殖、遷移及

14、侵襲能力的影響
　　 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性能力顯示，MCF-7及MDA-MB231轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖活性較空白對(duì)照組低，并分別從第2天和第3天起，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)提示MCF-7和MDA-MB231轉(zhuǎn)染組細(xì)胞克隆形成能力較空白對(duì)照組分別下降58.37±1.85％和62.80±0.78％，劃痕實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)顯示MCF-7細(xì)胞學(xué)轉(zhuǎn)染組細(xì)胞遷移能力減弱；Transwell實(shí)驗(yàn)則證實(shí)MDA-MB231轉(zhuǎn)染組細(xì)胞侵襲能力較空白

15、對(duì)照組減弱54.96±4.03％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；上述實(shí)驗(yàn)空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 4、下調(diào)端粒酶活性對(duì)乳腺癌細(xì)胞接受電離輻射、化療藥物治療敏感性的影響
　　 通過(guò)阿霉素模擬化療藥物作用，UV照射模擬電離輻射實(shí)驗(yàn)，并利用MTT法對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)各組細(xì)胞增殖活性進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染組細(xì)胞較空白對(duì)照組細(xì)胞接受放、化療后細(xì)胞增殖活性持續(xù)明顯下降，并呈現(xiàn)不可逆性表現(xiàn)，對(duì)照組與空白對(duì)照組無(wú)明顯差異，說(shuō)明端粒酶下調(diào)后

16、乳腺癌MCF-7和MDA-MB231細(xì)胞對(duì)電離輻射、化療藥物敏感性增加。
　　 結(jié)論:
　　 1、通過(guò)RNAi技術(shù)特異性干擾hTERT基因mRNA表達(dá)可顯著下調(diào)細(xì)胞端粒酶活性；
　　 2、乳腺癌細(xì)胞端粒酶活性下調(diào)可導(dǎo)致細(xì)胞增殖活性、遷移及侵襲能力的下降；
　　 3、端粒酶活性下調(diào)后可增加乳腺癌細(xì)胞對(duì)電離輻射、化療藥物的敏感性；
　　 4、以端粒酶為靶點(diǎn)的基因治療聯(lián)合電離輻射、化療等可能是乳腺癌治療