Adiponectin基因修飾的脂肪干細(xì)胞對野百合堿誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓大鼠的影響及機(jī)制.pdf

1、背景：肺動(dòng)脈高壓（pulmonary arterial hypertension，PAH）是一大類以肺動(dòng)脈壓力增高為特征的惡性肺血管疾病。肺血管重構(gòu)是其重要的病理特征，主要表現(xiàn)為肺動(dòng)脈內(nèi)皮受損、平滑肌層和外膜增厚、纖維化，血管周圍炎癥細(xì)胞浸潤，最終造成管腔狹窄、閉塞。延緩肺血管重構(gòu)，改善PAH患者心肺功能成為治療PAH，提高患者生存率的關(guān)鍵靶點(diǎn)。脂肪干細(xì)胞（adipose tissue-derived stem cells，ADSCs）

2、具有分化成多種細(xì)胞組織的潛能，可分泌多種細(xì)胞因子，增加內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮（nitric oxide，NO）的分泌，促進(jìn)血管再生。我們課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)，ADSCs能夠定植于野百合堿（monocrotaline，MCT）誘導(dǎo)的PAH大鼠的肺動(dòng)脈并分化為肺動(dòng)脈內(nèi)皮，降低肺動(dòng)脈壓力、改善肺動(dòng)脈和右心室重構(gòu)。脂聯(lián)素（adiponectin，APN）具有胰島素增敏、抗氧化、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗炎和抗增殖等多種生物學(xué)特性，能通過多重機(jī)制保護(hù)血管。我們

3、曾經(jīng)成功克隆過人APN全長基因，在此基礎(chǔ)上，我們將攜帶APN基因的慢病毒導(dǎo)入ADSCs，觀察APN基因修飾的ADSCs移植治療是否優(yōu)于單純的ADSCs移植治療，從而為肺動(dòng)脈高壓患者未來的干細(xì)胞和基因治療提供理論依據(jù)。
　　目的：①探討單純ADSCs移植和APN基因修飾的ADSCs移植對PAH大鼠心肺結(jié)構(gòu)及功能的影響。②探討單純ADSCs移植和APN基因修飾的ADSCs移植對PAH大鼠代謝模式的影響。③觀察APN對 PAH大鼠肺小動(dòng)

4、脈平滑肌細(xì)胞增殖情況的影響并探討其與BMP2/smad信號(hào)通路的聯(lián)系。
　　方法：⑴實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：本研究采用MCT誘導(dǎo)大鼠肺動(dòng)脈高壓動(dòng)物模型，觀察經(jīng)ANP基因修飾的ADSCs移植對PAH大鼠心血管結(jié)構(gòu)、功能及代謝組學(xué)的影響。80只SD大鼠，隨機(jī)分為正常對照組（NC組）、肺動(dòng)脈高壓組（PAH組）、脂肪干細(xì)胞治療組（ADSCs組）、導(dǎo)入空載慢病毒的脂肪干細(xì)胞治療組（ADSCs-V組）和APN基因修飾的脂肪干細(xì)胞治療組（ADSCs-APN組

5、）。PAH組、ADSCs組、ADSCs-V組和ADSCs-APN組給予一次性腹腔注射MCT40mg/kg，NC組予等量生理鹽水注射。MCT注射后14天，ADSCs組、ADSCs-V組和ADSCs-APN組分別經(jīng)頸外靜脈注13106cells/ml的ADSCs、感染空載慢病毒的ADSCs和APN基因修飾的ADSCs，PAH組和NC組予等量生理鹽水注射。（其中40只大鼠測壓，另外40只大鼠采血送代謝檢測及其他各項(xiàng)檢查）。⑵ADSCs培養(yǎng)：取

6、大鼠腹股溝脂肪組織，用酶消化法進(jìn)行脂肪干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)，流式細(xì)胞儀鑒定細(xì)胞免疫表型，成脂、成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)鑒定細(xì)胞多項(xiàng)分化功能。將過表達(dá)APN的慢病毒導(dǎo)入ADSCs，用ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液APN的表達(dá)。將導(dǎo)入APN的ADSCs移植入PAH大鼠體內(nèi)，激光共聚焦檢測其在肺組織的定位。⑶形態(tài)和功能研究：細(xì)胞移植3周后，右心導(dǎo)管法檢測各組大鼠平均肺動(dòng)脈壓（mean pulmonary arterial pressure，mPAP）、稱重法

7、計(jì)算右心室肥厚指數(shù)（right ventricular hypertrophy index，RVHI），肺小動(dòng)脈離體血管環(huán)張力試驗(yàn)評估血管收縮與舒張功能，HE染色觀察肺血管病理變化并計(jì)算肺小動(dòng)脈的管壁厚度指數(shù)（WT％）及相對管壁面積指數(shù)(WA%)，ELISA檢測血清APN含量，免疫組織化學(xué)染色檢測肺動(dòng)脈內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）的表達(dá)、超聲心動(dòng)圖檢測右心結(jié)構(gòu)及功能。

8、⑷代謝組學(xué)研究：采用核磁共振技術(shù)（NMR）技術(shù)，進(jìn)行血清NMR氫譜檢測分析各組代謝物濃度。采用Chenomx NMR Suite8.0軟件對NMR數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA、PLS-DA統(tǒng)計(jì)分析，利用排列檢測（Permutation test）檢驗(yàn)方法評價(jià)PLS-DA模型的質(zhì)量，p<0.001表示模型建立水平很好。⑸分子機(jī)制研究：酶消化法分離培養(yǎng)PAH大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（pulmonary arterial smoothmuscle cell，P

9、ASMCs），免疫細(xì)胞染色檢測其α-actin表達(dá)。分別用BMP抑制劑、腺苷酸活化蛋白激酶(AMP activated protein kinase,AMPK)抑制劑干預(yù)PASMCs，Western blot檢測骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（bone morphogenetic protein2，BMP2）、p-Smad1/5/8、Smad1/5/8/9、p-AMPK和AMPK蛋白的表達(dá)，CCK-8檢測細(xì)胞增殖情況。⑹統(tǒng)計(jì)方法：用SPSS19.0

10、統(tǒng)計(jì)軟件包對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。所有計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X±S）表示。組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）進(jìn)行分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Pearson相關(guān)分析心臟彩超測量值與mPAP、RVHI、WA%和WT%之間的關(guān)系。P<0.05定義為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：①ADSCs流式細(xì)胞儀鑒定CD29和CD90陽性、CD34、CD45和 CD31陰性，成脂誘導(dǎo)7天后油紅染色見細(xì)胞漿內(nèi)脂滴染成紅色，成

11、骨誘導(dǎo)茜素紅染色顯示胞漿內(nèi)的鈣化顆粒被染成棕紅色。導(dǎo)入APN基因的ADSCs能夠穩(wěn)定表達(dá)APN蛋白，并在肺組織定位。移植APN高表達(dá)的ADSCs能降低PAH大鼠mPAP(NC組:16.38±0.91mmHg；PAH組：32.62±1.77 mmHg；ADSCs組：27.11±2.12 mmHg；ADSCs-V組：26.44±2.91mmHg；APDSCs-APN組：21.44±0.89mmHg；P<0.05)、RVHI(NC組:25.7

12、9±1.81%；PAH組：56.27±2.18%；ADSCs組：47.94±2.87%；ADSCs-V組：47.57±3.39%；APDSCs-APN組：45.23±1.95%；P<0.05)、WT%和 WA%；肺小動(dòng)脈內(nèi)皮依賴性的舒張功能和非內(nèi)皮依賴性的舒張功能得到同步改善，肺小動(dòng)脈內(nèi)膜eNOS的表達(dá)明顯增強(qiáng)。超聲心動(dòng)圖顯示右室結(jié)構(gòu)及功能均有不同程度的恢復(fù)。APN基因修飾的ADSCs移植治療效果優(yōu)于單純的ADSCs移植治療。心臟彩超各

13、測量值與mPAP、RVHI、WA%和WT%之間的存在不同程度的相關(guān)性。②PAH大鼠血清代謝物中血清葡萄糖、乳酸濃度明顯升高，血清丙氨酸濃度明顯降低。APN基因修飾的ADSCs移植治療能降低PAH大鼠血清葡萄糖、乳酸濃度，升高血清丙氨酸濃度。單純ADSCs移植治療不能明顯改變PAH大鼠代謝模式。③APN呈濃度依賴性地增加肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞BMP2的表達(dá)，BMP的抑制劑可減少APN誘導(dǎo)的BMP2、p-Smad1/5/8蛋白的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖

14、；AMPK抑制劑可減少APN誘導(dǎo)的p-AMPK和BMP2蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)論：⑴導(dǎo)入APN基因的ADSCs移植后可定位于肺組織，并分泌APN。ADSCs和APN基因修飾的ADSCs治均可在不同程度上增加肺血管內(nèi)皮eNOS的表達(dá)，減少肺動(dòng)脈重構(gòu)，改善血管舒張功能，降低肺脈高壓，改善右心室功能。APN聯(lián)合ADSCs移植治療優(yōu)于單純ADSCs移植治療。右心結(jié)構(gòu)\功能與肺動(dòng)脈重構(gòu)密切相關(guān)。⑵APN基因修飾ADSCs移植治療可以改善MCT